R电转化K.oxytoca HD79/pKD46 方法同质粒PKD46转化K.ocytoca HD79。得到的目的菌株为高产2,3_丁二醇的产酸克雷伯 氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-01。
[0092] 8、重组菌株K.oxytoca HD79-01 产2,3-丁二醇实验
[0093] 将重组菌株K.oxytoca HD79-01和出发菌株K.oxytoca HD79分别接种到种子液培 养基中，30°C，150r/min培养至对数生长期，以5%接种量分别接种到装液量为15〇1111750〇1^ 发酵培养基中，底物葡萄糖15(^凡，30°(：，15(^/1^11发酵15611后结束。每隔1211取样，测定其 pH和。样品经处理后，经高效液相色谱检测乳酸、2,3_ 丁二醇产量以及葡萄糖浓度。 结果如图7,8。
[0094]由图7可知原始菌株生长速率快，在60h达到最大值，OD6mnmS〇. 817，随着发酵时间 的延长逐渐趋于平稳。而重组菌株一开始生长缓慢，在48h后超过原始菌株并一直增大，在 108h达到最大，0D6QQnmSl.045。总体而言，重组菌株生长明显优于原始菌株。两者的pH值变 化均处于下降趋势，但是重组菌株发酵液中的pH略高于原始菌株，介于0.05和0.55之间，原 因可能是重组菌株敲除ldh基因致使酸性产物乳酸的产量降低，导致发酵液中pH升高。
[0095]从图8可知，由于重组菌株生长优于原始菌株，所以相对应的葡萄糖消耗速率也明 显高于原始菌株。在l〇8h，重组菌株K.oxytoca HD79-01消耗的葡萄糖达到最大，为初始用 量的68.9% ;而原始菌株葡萄糖的消耗明显小于重组菌株，在132h，葡萄糖消耗最多，为初 始用量的62.1 %。相对于2,3_ 丁二醇的产量变化来说，重组菌株在84h，2,3-丁二醇的产量 达到最大值为40.20g/L，此时原始菌株的2，3-丁二醇为29.83g/L，是重组菌株的0.74倍;而 原始菌株在96h，2，3-丁二醇的产量达到最大值为31.71g/L，此时重组菌株的2，3-丁二醇的 产量为39.77g/L，是原始菌株的1.25倍。鉴于2,3_丁二醇是目标产物，因此在发酵进程中选 取2,3_ 丁二醇产量最高的时间点作比较，即重组菌株84h的2,3_ 丁二醇产量是原始菌株96h 的2,3_ 丁二醇1.27倍，差异显著(p〈0.05)。此时，重组菌株2,3_ 丁二醇的产量的生产强度为 0.48g/L · h，转化率为0.38g/g，原始菌株的2,3_丁二醇的产量的生产强度为0.33g/L · h， 转化率为〇.34g/g，分别提高了 45.5%和11.8%，差异显著(？〈0.05)。在2,3-丁二醇产量出 现峰值以后，葡萄糖还继续消耗，这是由于葡萄糖继续用于其它代谢产物的生成。另外，利 用该重组菌株获得的2，3-丁二醇纯度由59.7%增加到67.8%。
【主权项】
1. 高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按W 下步骤进行： 一、 1化基因同源左臂片段Idh-L和右臂片段Idh-R的构建： W产酸克雷伯氏菌皿79基因组DNA为模板，分别用1化-1^1、1化-L2和1化-Ri、1化-R2引物 进行PCR反应； 二、 Pl化-L和Pl化-R质粒构建： 向含有Idh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25化5U/化的 化qDNA聚合酶，72°C水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段1化-L和1化-R，将 片段1化-L和1化-R分别与pMD 18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为P1化-L和P1化-R; S、Pl化-LR质粒构建： Wpl化-L为骨架，选用限制性内切酶趾O I和EcoR I对质粒载体Pl化-L与Pl化-R分别 进行双酶切，用T4DNA连接酶将Pl化-R的酶切产物连接到Pl化-L质粒载体上，得到重组质粒 PIdh-LR; 四、 pT-Cnf质粒构建： WpGP704-Cm为模板，利用Cm-UP和Cm-down为扩增引物，对Cnf进行PCR扩增，对PCR产物 进行TA克隆，得到pT-Cnf质粒； 五、 同源重组片段1 -1化R的构建： W重组质粒Pl化-LR为骨架，选用限制性内切酶化O I对重组质粒pT-Cnf和Pl化-LR进行 酶切，将获得的Cnf片段插入质粒载体Pl化-LR中，构建质粒载体pT-LCR; 选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段 WhkCnf-WhR; 六、 K.0巧toca皿79/p邸46菌株构建： 将质粒地D46电转化到K. O巧toca皿79感受态细胞，得到K. O巧toca皿79/p邸46菌株； 屯、同源重组片段1化心〇]/-1化R转化K.oxytoca皿79/p邸46: 将同源重组片段1化心〇11^-1化R电转化到K.0巧toca皿79/p邸46中，得到的目的菌株为 高产2，3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.O巧toca皿79-01。2. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤一中 1 化-b 引物序列为5 ' -GGAAGATCTCAGTACGACAAGAAGTATCTG-3 '，Idh-Ls 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGACCGAAGCCTTTAAGAATGCGCAGC-3 '，Idh-Ri 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGCTTCGGTATGCGCCTGCT-3'，ldh-R2 引 物序列为5'-GGAGGATCCTCAGACCAGCGCGTTAGGG-3 '。3. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤一中PCR反应体系如下： PC民反应体系组分 加入体积 终浓度 1 OxP化 BuflTer VVi比 MgS〇4 5 uL |/ clNTPs 5 jiL fi- 0.2 inmol/[jL 上游引物 2阵 0.4叫noi/yL 下游引物 2uL 0.4 ^irnol/uL 模板 DNA iOuL - Pfu DNA Polymerase I |iL AQSU/hL ddHzO 25 ^iL - PCR扩增的反应程序为： 步骤 溫度 时间 循环数 预变性 94 Sffiin 1 变 t'T; 94'C 1 min iLi 火 58'仁' Imin 30 延伸 7：rC Ifflin 终延伸 72 C Imm 1 。4. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤四中 Cm-UP 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGGCTTGCGCAGACCAAAACG-3 ' 和Cm-down 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGGCAGGCATGCAAGCTTGGT-3 '。5. 根据权利要求1所述的高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法， 其特征在于步骤四中PCR反应体系如下： PCR反应体系组分 加入体积 终浓度 化邻氏I Buffer W地.Mg'S〇4. 5 [iL 1 乂 dNTPs 5 [iL .各 0.2 mmol心L 上游引物 21山 0.4 jimol/nL 下游引物 2阵 0.4 iimol/nL 模板DNA 10冲 - P扣DNA聚合酶 1阵. 日.05 U/.uL 加战打 25 (iL - PCR反应程序如下： 步骤 温度 时阁 循环数 预变性 94'C 5 min 1 变性 94 C Imin 退火 59'C Imin 3日 延伸 72'C 1.Srnin 终延伸 TTC 7min 1。6.如权利要求1所述的方法构建得到的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按W 下步骤进行： 一、 将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytoca HD79-01单菌落接种到种子液培养基中， 30°C，150r/min培养至对数生长期，得种子液； 二、 然后将种子液W5%的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中，于30 °C，150r/min发酵15化后结束。 步骤一中所述种子液培养基配方：（NH4)2S04 lg/L、K2HP〇4.3出0 3.4g/L、K出P〇4 1.3g/ L、MgS〇4 0.2g/L、酵母提取物Ig/L、微量元素2mL/L和铁溶液ImL/L，调抑值至7.0，121°C高 压灭菌15min，之后向每IOOmL种子培养基中加入经108°C高压灭菌20min的5g葡萄糖粉末； 步骤二中所述发酵培养基配方：（畑4)25〇4 6.6邑/1、1(2册〇4*3出0 8.7邑/1、1(出?〇4 6.8邑/ L、MgS〇4 ? 7此0 0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeS〇4 ? 7此0 0.05g/L、ZnS〇4 ? 7出0 O.OOlg/L、 MnS〇4 ? 7此0 O.OOlg/L和CaCl2 ? 2出0 O.OOlg/L，调整溶液的抑值至7.0，12rC高压灭菌 15min，然后在其中加入经108°C高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。
【专利摘要】高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法，涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题。构建方法：一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建；二、pldh-L和pldh-R质粒构建；三、pldh-LR质粒构建；四、pT-Cmr质粒构建；五、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR的构建；六、K.oxytoca？HD79/pKD46菌株构建；七、ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytoca？HD79/pKD46。发酵方法：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株接种到种子培养基中，培养至对数生长期，得种子液；二、将种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，发酵，结束。本发明用于生产2,3-丁二醇。
【IPC分类】C12N1/20, C12P7/18, C12R1/22, C12N15/74
【公开号】CN105647954
【申请号】
【发明人】葛菁萍, 孙姗姗, 叶广斌, 宋刚, 平文祥, 修宝林
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月18日