高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高产2,3_ 丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。
【背景技术】
[0002] 产酸克雷伯氏菌(1(1613186113(?71:〇〇3)作为2,3-丁二醇的产生菌，具有适应环境 能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点被认为是工业 化生产的潜在菌株。但是，酸性副产物乳酸的积累仍是限制2,3_ 丁二醇产量提高的主要因 素，发酵过程中乳酸含量的增加，会抑制菌体的生长，不但降低了 2,3_ 丁二醇的产量，同时 增加了后续对2，3_ 丁二醇分离纯化的复杂性。
[0003] 另外，还存在2,3_ 丁二醇转化率低、生产强度低及纯度低的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3_丁二醇产量低、转化率低、生产强 度低及纯度低的问题，提供高产2，3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其 发酵方法。
[0005] 本发明高产2,3_ 丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进 行：
[0006] -、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：
[0007] 以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-Lhldh-L〗和ldh-Rhldh-R〗 引物进行PCR反应；
[0008] 二、pldh-L 和 pldh-R 质粒构建：
[0009] 向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25yL Taq(5UAi L)DNA聚合酶，72 °C水浴中反应1 Omiη，将目的条带胶回收纯化，获得片段1 dh-L和1 dh-R，将 片段1 dh-L和1 dh-R分别与pMD 18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为p 1 dh-L和p 1 dh-R;
[0010] 三、pldh-LR质粒构建：
[0011] 以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和EcoR I对质粒载体pldh-L与pldh-R 分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组 质粒pldh-LR;
[0012] 四、pT-Cnf质粒构建：
[0013] 以PGP704-Cm为模板，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cnf进行PCR扩增，对PCR 产物进行TA克隆，得到pT-Cnf质粒；
[0014] 五、同源重组片段1 dhL-Cm1-1 dhR的构建：
[0015] 以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT-Cm"和pldh-LR进行酶切，将获得的Cnf片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR;
[0016] 选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片 段ldhL-Cmr-ldhR;
[0017] 六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建：
[0018] 将质粒pKD46电转化到K.oxytoca HD79感受态细胞，得到K.oxytoca HD79/pKD46 菌株；
[0019] 七、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46:
[0020] 将同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR电转化到K.oxytoca HD79/pKD46中，得到的目的 菌株为高产2，3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-01。
[0021 ] 步骤一所述产酸克雷伯氏菌（K.oxytoca)HD79已在文献《Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因（ack)的克隆与序列分析》（中国农学通报，2015。31(14):83-88)中 公开。
[0022]上述方法构建的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：
[0023] 一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytoca HD79-01单菌落接种到种子液培养 基中，30°C，150r/min培养至对数生长期，得种子液；
[0024]二、然后将种子液以5%的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中， 于30°C，150r/min发酵156h后结束。
[0025]步骤一中所述种子液培养基配方：（NH4)2S〇4 lg/L、K2HP〇4 · 3H20 3.4g/L、 KH2P0U · 3g/L、MgS〇4 0 · 2g/L、酵母提取物lg/L、微量元素 2mlVL和铁溶液lmL/L，调pH值至 7.0,121°C高压灭菌15min，之后向每100mL种子培养基中加入经108°C高压灭菌20min的5g 葡萄糖粉末；
[0026]步骤二中所述发酵培养基配方：（NH4)2S〇4 6.6g/L、K2HP〇4 · 3H20 8.7g/L、KH2P〇4 6.8g/L、MgS〇4 · 7H20 0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeS〇4 · 7H20 0.05g/L、ZnS〇4 · 7H20 0.001g/L、MnS〇4 · 7H20 0.001g/L和CaCl2 · 2H20 0.001g/L，调整溶液的pH值至7.0，121°C 高压灭菌15min，然后在其中加入经108°C高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。
[0027]本发明的原理：
[0028] ldh基因编码的乳酸脱氢酶是乳酸代谢途径的关键酶，本发明利用XRed同源重组 技术对K.oxytoca HD79中ldh基因敲除，阻断乳酸的生成途径，促使碳流量更多流向2,3_丁 二醇，以期获得2，3_ 丁二醇高产菌株。
[0029] 首先，通过PCR技术扩增得到乳酸脱氢酶基因的同源左右两臂片段，然后将该两臂 片段连接到氯霉素抗性基因的左右两翼，形成一个表达盒ldhL-Cnf-ldhR。将该表达盒转入 产酸克雷伯氏菌中，通过同源重组的方式，以氯霉素抗性基因替代乳酸脱氢酶基因，从而完 成对乳酸脱氢酶基因的敲除。获得突变株由于不能有效的产生乳酸，使菌株代谢通路发生 改变，提高了 2，3-丁二醇的产量。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 本发明成功敲除产酸克雷伯氏菌(Klebisella 〇Xyt〇ca)HD-79的ldh基因，构建 Klebisella oxytocaHD-79-Ol菌株，减少乳酸的产量，提高了2,3_丁二醇的产量。
[0032]其中2，3-丁二醇的产量由31.71g/L提高到40.20g/L，提高了26.8%。而乳酸则由 4 · 83g/L下降到2 · 45g/L，降低了 49 · 3 %。
[0033] 2,3_丁二醇转化率提高了 11.8% ;2,3_丁二醇的生产强度由0.33(g/L·!!)增加到 0.48(g/L · h)，提高了45.5%。另外，利用该菌株获得的2,3-丁二醇纯度由59.7%增加到 67·8%〇
[0034] 本发明关于基因敲除高效生产2,3_ 丁二醇的构建研究将为今后基因功能的研究 提供理论依据。
【附图说明】
[0035] 图1为ldh-L基因和ldh-R基因 PCR扩增产物电泳图；
[0036] 图2为ldh-L基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
[0037] 图3为ldh-R基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
[0038] 图4为Cm-up、Cm-down引物对的PCR扩增结果；其中Μ为DNA Marker DL2000;泳道1-2为Cnf基因的PCR产物；
[0039] 图5为Cnf基因阳性克隆菌液PCR验证结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道1-5 为阳性克隆菌液PCR扩增产物；
[0040] 图6为ldh-Li、ldh-R2引物对PCR结果;其中Μ为DNA Marker DL2000,泳道 1-2为PCR 产物；
[0041 ]图7为出发菌株和重组菌株的pH值及0D值对比，其中?表示出发菌株K.oxytoca HD79的0D值，?表示重组菌K. oxytoca HD79-01的0D值，▲表示出发菌株K. oxytoca HD79的 pH值，Λ表示重组菌K · oxytoca HD79-01的pH值；
[0042]图8为出发菌株和重组菌株的葡萄糖消耗及2,3_丁二醇产量对比，其中?表示出 发菌株K. oxytoca HD79的葡萄糖消耗，?表示重组菌K. oxytoca HD79-01的葡萄糖消耗，▲ 表示出发菌株K.oxytoca HD79的2,3-丁二醇产量，Λ表示重组菌K.oxytoca HD79-01的2， 3_ 丁二醇产量。
【具体实施方式】
[0043]【具体实施方式】一:本实施方式高产2,3_ 丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构 建方法，按以下步骤进行：
[0044] -、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建；
[0045] 二、pldh-L 和 pldh-R 质粒构建；
[0046] 三、pldh-LR质粒构建；
[0047] 四、pT-Cnf质粒构建；
[0048] 五、同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR的构建；
[0049] 六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建；
[0050] 七、同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46。
[0051 ]本实施方式首先PCR扩增ldh基因同源左臂片段ldh-L产物与目的片段大小相符约 489bp，将ldh-L基因片段连接入pMD18-T质粒载体，构建pldh-L质粒，经PCR验证及Bgl II、 Xho I双酶切验证上述质粒载体构建正确。PCR扩增ldh基因同源右臂片段ldh-R产物与目的 片段大小相符约400bp，将ldh-R基因片段连接入pMD18-T质粒，构建pldh-R质粒，