经PCR验证 及Xho I、BamH I双酶切验证上述质粒载体构建正确。以质粒载体pGP704-Cm为模板，利用 Cm-up和Cm-down为引物对氯霉素抗性基因进行PCR扩增。PCR扩增氯霉素抗性基因（Cnf)产 物与目的片段大小相符约876bp，与设计的预期相符。将Cnf基因片段连接入pMDIS-T质粒载 体，构建pT-Cn^质粒，经PCR验证及Xho I酶切验证质粒载体构建正确。以pldh-LR为骨架，在 1 dh基因同源臂插入打断基因 Cnf;经BamH I与Bg 1 Π 酶切验证正确。电转化质粒pKD46到 Klebisella oxytocaHD-79构建Klebisella oxytocaHD_79/pKD46;将同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR转化到经L-阿拉伯糖诱导的K.oxytoca HD-79/pKD46中，以达到敲出乳酸脱氢酶 基因的目的。
[0052]本实施方式中每个步骤的具体内容及结果如下：
[0053] l、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建
[0054] 以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-Lhldh-Ui和ldh-Riadh-R〗 引物进行PCR反应，引物序列如表1，反应体系如表2，反应程序如表3，结果如图1。图1中Μ为 DNA Marker DL2000,泳道1为ldh-L基因 PCR产物，泳道2为ldh-R基因 PCR产物。
[0055] 表1引物序列
[0056]
[0057] 表2 ldh左臂和右臂扩增的PCR反应体系组分
[0058]
[0059]~表3右臂和左臂PCR扩增的反应程序
[0060]
[0061 ] 2、pldh-L 和 pldh-R 质粒构建
[0062]向含有乳酸脱氢酶基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25yL Taq(5U/yL)DNA聚合酶，72°C水浴中反应1 Omin。将目的条带胶回收纯化，获得的1 dh的左臂 和右臂与pMD 18-T载体在16 °C水浴中过夜连接，即进行"TA"克隆，反应体系如表4。获得克隆 载体分别命名为pldh-L和pldh-R。将其转入到转化至E.coli DH5a中。分别挑取5株白色菌 株进行PCR鉴定和酶切验证，反应体系如表5和表6WCR验证ldh-L结果如图2所示：1-5号阳 性克隆扩增得到的片段长度均与ldh-L片段大小相符，为489bp;PCR验证ldh-R结果如图3所 示：1_5号阳性克隆扩增得到的片段长度均与ldh-R片段大小相符，为400bp。质粒载体pldh-L与pldh-R构建成功。
[0063] 表4 ldh的左臂和右臂连接体系组分
[0064]
[0065]
[0066] 表5 ldh的左臂和右臂菌液PCR验证反应体系组分 [0067] L0070J 3、pldh_LK 质杈构建
[0071] 以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和EcoR I对质粒载体pldh-L与pldh-R 进行酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R(Xho I/EcoR I)的酶切产物连接到pldh-L(Xho I/EcoR I)质粒载体上。连接反应在16°C条件下过夜进行，连接反应体系如表7,反应程序：16°C，过 夜。连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，抗生素筛选终浓度为Amp 100yg/mL和Cm 150μ g/mL。对重组质粒的阳性转化子以引物分别是ldh-LjPldh-R2进行菌液PCR验证及用限制性 内切酶Bgl II和BamH頂每切验证。结果表明重组质粒pldh-LR构建成功。
[0072]表7骨架载体pldh-L与目的基因 ldhR连接反应体系
[0073]
[0074] 4、pT_Cmr 质粒构建
[0075] 本发明克隆氯霉素抗性基因（Cnf)将其作为打断基因，插入乳酸脱氢酶基因的同 源序列中，使乳酸脱氢酶基因失活。同时，Cn^也可作为后续工程菌株的筛选标记。以 pGP704-Cm为模板（质粒pGP704-Cm购买自普如汀生物技术有限公司，货号3617178)，利用 Cm-up和Cm-down为扩增引物(序列如表1)，对Cnf进行PCR扩增。PCR反应体系如表2，反应程 序如表8JCR结果见图4JCR产物加"A"、目的条带胶回收纯化、"TA"连接、E.coli DH5a感受 态细胞的制备及连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，筛选(含Amp，Cm终浓度为100yg/ mL)菌落，接种到LB液体培养基培养。对阳性克隆子进行菌液PCR验证。引物替换成Cm-up和 Cm-down。用限制性内切酶Xho I对阳性重组质粒进行酶切验证，酶切反应体系见表9。菌液 PCR结果见图5。
[0076] 表8 Cnf扩增的PCR反应程序
[0077]
[0078] 表9 pT-Cnf酶切验证反应体系 [0079]
^〇?~如图5所示：1_5号阳性克隆扩增得到的片段长度均与Cnf片段大小相符，为876bP<3_ 重组质粒p T-Cnf构建成功。
[0081 ] 5、同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR的构建
[0082] 构建最终的同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR前，先行构建了 pldh-LR、pT-LCR，其中 pldh-LR是将部分ldh左右同源臂基因整合在一起的质粒，已构建完;pT-LCR是以pldh-LR为 骨架载体，在ldh同源臂中间插入了打断基因 Cnf;然后通过酶切的方法获得同源重组片段 ldhL-Cmr-ldhR〇
[0083] (1)以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT-CmT和 pldh-LR进行酶切，将获得的Cm"片段插入质粒载体pldh-LR中，构建成质粒载体pT-LCR。 pldh-LR和pT-Cnf选择二者共有酶切位点Xho I，对重组质粒pldh-LR和pT-Cnf分别进行酶 切，酶切反应体系见表8。酶切反应条件均为37°C下作用4h。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 胶回收并纯化目的条带。经酶切反应后，条带大小与重组质粒pldh-LR(3581bp)相符，说明 pldh-LR酶切成功。条带大小分别与Cii^片段(876bp)和pMD18-T(2692bp)相符，说明pT-Cn^酶 切成功。两者的酶切产物pldh-LR和Cnf经胶回收纯化后可用于后续构建pT-LCR试验。
[0084] 用T4DNA连接酶将pT-Cnf(Xho I)的酶切产物Cnf连接到pldh-LR · (Xho I)质粒载 体上，连接反应在16 °C条件下过夜进行，连接产物转化E. co 1 i DH5a感受态细胞，抗生素筛 选终浓度为Amp 100yg/mL和Cm 150yg/mL。挑取菌落，接种到LB液体培养基(含Amp 100yg/ mL和Cm 150yg/mL)中，37°C，150r/min过夜培养。对阳性克隆子进行菌液PCR验证。结果见图 6。引物分别是ldh-LjPldh-R 2。用限制性内切酶Bgl II和BamH I对阳性重组质粒进行酶切 验证。验证正确阳性重组质粒命名为pT-LCR。
[0085] 如图6所示：泳道1-2均在1000bp和2000bp之间有一清晰的条带，与ldhL-Cnf-ldhR (去除骨架PMD18-T部分）即ldh-LRXnf片段大小之和相符，为1765bp，初步说明目的基因 ldhL-Ci^-ldhR连接到pMD18-T克隆载体上。用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切重组质粒 pT-LCR，结果显示重组质粒pT-LCR被Bgl II和BamH I完全酶切在约2000bp和2500bp处产生 两条清晰的条带，其大小分别与骨架pMD18-T(2692bp)和目的片段ldhL-CmMdhR(1765bp) 相符，进一步证明重组质粒pT-LCR构建成功。
[0086] (2)构建的质粒载体pT-LCR含有完整的基因敲除序列，即同源基因中插入了打断 基因的序列。对质粒载体pT-LCR进行酶切，可获得用于ldh基因敲除的同源序列，即为同源 重组片段ldhL-Cnf-ldhR。选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT-LCR进行酶切。 验证正确的线性片段命名为ldhL-Cnf-1 dhR。
[0087] 选用限制性内切酶Bgl II和BamH I对重组质粒pT-LCR进行酶切，其结果显示重组 质粒pT-LCR被Bgl II和BamH I完全酶切在2000bp左右处产生两条清晰的条带，其大小分别 与骨架pMD18-T(2692bp)和目的片段ldhL-Cnf-ldhR(1765bp)相符，对目的片段进行胶回收 并纯化可用于后续电转化试验。
[0088] 6、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建
[0089]本实验选用的同源辅助质粒pKD46(质粒pKD46购买自普如汀生物技术有限公司， 货号BioVectorl058)不仅编码XRed重组系统Exo、Bet和Gam三种蛋白因子，并受到L-阿拉伯 糖的诱导表达，而且其本身含有氨苄青霉素抗性基因筛选标记。制备K.oxytoca HD79电转 化感受态细胞，取纯化后PKD46 10yL与50yL K.oxytoca HD79感受态细胞充分混合后，转移 至0.2cm预冷电转化杯中电击。电转化仪电击参数设置为电压1.8kV，电容25yF，电阻200 Ω。 电击结束后，立即用lmL新鲜LB液体培养基悬浮电转化杯内的菌液，30°C、150r/min摇床培 养4h。菌液6000r/min离心3min收集菌体。用100yL LB液体培养基重悬浮沉淀，然后涂布于 含有2mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，30 °C恒温培养过夜。挑取转化的单菌落，接种于 20mL LB培养基中（含2mg/mL氨卡青霉素），30°C振荡培养12-16小时或过夜，保菌。
[0090] 7、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46
[0091] 将同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR电转化到含有经过5mM L-阿拉伯糖诱导的同源辅 助质粒PKD46的K.ocytoca HD79宿主菌中，使其与宿主菌中的乳酸脱氢酶基因发生区域同 源重组，以达到敲除乳酸脱氢酶基因的目的。ldhL-Cnf-ldh