[0052](2)反转录合成cDNA第一链
取已连接5'端接头的反应液2yL进行反转录，反转录反应体系为:Ligated RNA 2 yL,dNTP Mix 4 yL,Random Decamers 2 yL,1X RT Buffer 2 yL,RNase Inhibitor I yL，M_MLV Reverse Transcriptase I yL,NucIease-free Water To 20 yL。
[0053]充分混匀，短暂离心，然后42°C孵化I小时，获得的反转录产物用于巢式PCR扩增反应。
[0054](3)巢式PCR反应扩增
以上一步反转录的产物作为模版，利用靶基因特异的外部引物和接头的外部引物进行5 ' R A C E巢式P C R的第一步反应，基因外部引物和接头的外部引物为:CAAGGCTCATTACAGGCCACC和CTGAACCTCCTTGTCACATGGC，反应液在冰上配制，反应体系为:RTreact1n (from the prev1us step) I yL，10X PCR Buffer 5 yL，dNTP Mix 4 yL,57RACE gene-specific outer primer (10 μΜ) 2 yL,5/ RACE Outer Primer 2 yL，Nuclease-free Water To 50 yL，thermostable DNA polymerase (0.25 yL of 5U/yL)1.25U
反应程序为:
预变性:94 °C 3min；
扩增:94 °C 30 s，60 °C 30 sec，72 °C 30 sec(35次循环)；
延伸:72°C 7 min。
[0055]利用巢式PCR第一步反应的产物作为模板，以靶基因特异的内部引物和接头的内部引物进行巢式P C R的第二步反应，基因内部引物和接头的内部引物为:CAAGGCTCATTACAGGCCACC和CTGAACCTCCTTGTCACATGGC，反应体系为:Outer PCR (from theprev1us step) 2 yL,10X PCR Buffer 5 yL，dNTP Mix 4 yL,57 RACE gene-specificinnter primer (10 μΜ) 2 yL,57 RACE inner Primer 2 yL,NucIease-free Water To50 yL,thermostable DNA polymerase (0.25 yL of 5 U/yL) I.25U。反应程序与巢式PCR第一步反应相同。
[0056](4)目的片段与T载体的连接
扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图2所示，切下目的片段用天根生化公司的柱式DNA胶回收试剂盒回收，纯化回收的具体方法严格按照说明书操作。回收产物连接到pMD?18-T Vector，连接反应体系:pMD? 18-T Vector IyL,Solut1n I 4 yL，回收片段 4 yL，CldH2O I yL
(5 )连接产物的转化及测序
将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，每个靶基因选取至10个阳性克隆采用Solexa高通量测序技术进行测序，测序的结果如附图3所示(箭头所指位置为miRNA降解靶基因的断裂位置)。
[0057]结合附图3和附图4的结果说明，stu-miR5992a和stu-miR5992b能够将靶基因NAC类转录因子(PGSC0003DMG400032555)mRNA特异性断裂，从而使靶基因表达下调。
[0058]3、干旱胁迫下stu_miR5992a和stu_miR5992b表达量的分析
分别将不同干旱处理阶段的RNA反转录合成cDNA。用SYBR ? Premix Ex TaqII ?荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒检测靶基因在不同干旱处理阶段的表达情况，以延伸因子(efla)基因作为内参，反应体系如下:SYBR ? Premix Ex TaqTM II(2X) 10 yL，qGUS_l(10 μΜ)
0.8 yL,qGUS-2(10 μΜ)0.8 yL，R0X Reference Dye II(50X) 0.4 yL，RT反应液 I yL，CldH2O 7 yLo
[0059]qRT-PCR反应条件为:
95°C预变性10 min 95°C变性 15 sec
60 °C I min 40个循环72 °C 30 sec
计算公式:应用公式RQ(相对表达量)=2—计算在处理前后的相对表达量，Δ ACt=(ACt处理样品一ACt efla) — ( ACt对照样品一ACt efla)。引物序列为:CGAAAGCGGUUUACAAUGAUGAG和Un1-miR qPCR PrimerCTaKaRa RR717)。
[0060]本研究鉴定出马铃薯干旱相关的新miRNA (unconservative_ST4.03chll_2997600/3000428)靶向作用于NAC类转录因子(PGSC0003DMG400032555)，在干旱胁迫下11^1?财(8切1丨1?59923和8如1丨1?599213)下调表达将导致其靶基因難(:类转录因子(PGSC0003DMG400032555)表达量的上调必将增强植物对干旱的耐受性。如附图5所示，本发明通过荧光定量PCR表达分析显示miRNA(stu-miR5992a和stu-miR5992b)马铃薯耐旱型品种紫花白干旱胁迫下下调表达，但再干旱敏感型品种大西洋上调表达。这些结果表明，NAC转录因子在植物抗干旱等非生物逆境中起着重要的调控作用，特别对不同品种抗旱能力差异的调控，将在作物抗旱育种中具有潜在的应用价值。因此，在马铃薯中过表达Stu-miR5992a和stu-miR5992b基因，或者抑制stu-miR5992a和stu-miR5992b表达将会培育出具有高抗旱能力的马铃薯转基因品种。
[0061]以上所述仅是本申请的【具体实施方式】，仅作为本发明可实施的技术方案提出；应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以对实验步骤做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
【主权项】
1.马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b，其特征在于所述stu_miR5992a的序列如序列表SEQ ID N0:1所示;所述stu-miR5992b的序列如序列表SEQ ID N0:2所示。2.根据权利要求1所述的马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b，其特征在于所述stu-miR5992a序列的二级结构为:自5'端llbp_17bp和84bp_90bp形成环状，自5'端18bp_20bp和81bp_83bp形成环状，自 5'端23bp_26bp和75bp_78bp形成环状，自 5'端26bp_30bp和70bp-75bp形成环状，自5'端39bp_41bp和57bp_60bp形成环状，自5'端45bp_53bp形成环状，其他碱基配对形成莖环结构；所述stu_miR5992b序列的二级结构为:自5'端3bp_6bp和54bp-57bp形成环状，自 5'端 16bp_18bp和45bp_47bp形成环状，自 5'端 19bp_23bp和40bp_44bp形成环状，自5'端28bp-35bp形成环状，其他碱基配对形成茎环结构。3.根据权利要求1所述的马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b，其特征在于编码所述stu_miR5992a序列的DNA序列如序列表SEQ ID NO:3所示；编码所述stu_miR5992b序列的DNA序列如序列表SEQ ID NO:4所示。4.根据权利要求1所述的马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b，其特征在于所述stu-miR5992a和stu-miR5992b共同的成熟序列如序列表SEQ ID N0:5所示。5.根据权利要求4所述的马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b，其特征在于所述stu-miR5992a和stu_miR5992b共同的成熟序列是stu_miR5992a序列自5'端88bp_108bp的一段RNA序列;或者是stu-miR5992b序列自5'端85bp_105bp的一段RNA序列。6.权利要求1所述的马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b在研究靶基因功能中应用。7.根据权利要求6所述的马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b在研究靶基因功能中应用，其特征在于所述靶基因为NAC类转录因子(PGSC0003DMG 400032555)，靶基因序列如序列表SEQ ID NO:6所示。8.根据权利要求6所述的马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b在研究靶基因功能中应用，其特征在于所述stu_miR5992a和stu_miR5992b通过特异性降解革El基因，使革El基因表达下调而研究靶基因功能。9.权利要求1所述的马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b在培育抗旱转基因植物中的应用。10.根据权利要求9所述的马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b在培育抗旱转基因植物中的应用，其特征在于所述转基因植物为马铃薯。
【专利摘要】本发明提供了一种马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b及其应用。RLM-5′RACE测检结果表明stu-miR5992a和stu-miR5992b调控马铃薯NAC类转录因子(PGSC0003DMG400032555)，可用于研究该NAC类转录因子基因的功能，即通过缺失表达或过表达该NAC类转录因子时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR5992a和stu-miR5992b的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/113
【公开号】CN105647928
【申请号】
【发明人】张宁, 司怀军, 文义凯, 周香艳, 王丽, 朱熙, 杨江伟, 唐勋
【申请人】甘肃农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年4月6日