马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明专利涉及一种mi croRNA(miRNA)及其应用，具体地说是马铃薯stu-miR5992a 和 stu-miR5992b 及其应用。
【背景技术】
[0002]miRNA是一类非编码的单链小分子RNA，长约20 nt的内源性非蛋白编码RNAt3HiiRNA基因最初转录产生具有莖环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定革E基因的mRNA结合，通常在转录后水平引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。
[0003]干旱胁迫是最主要的非生物胁迫之一，其对农作物的生长发育和产量造成极其严重的影响。据统计，地球上总土地面积的36%属于缺水的干旱或半干早区域，我国干旱和半干早区域大约占国土地面积的1/2。即使在半湿润和湿润的农业主产区，也通常会受到季节性和周期性的旱灾侵袭。干旱胁迫对农作物产量、质量的影响相当于其余自然灾害之和，其危害性在各种自然逆境胁迫中占首位，仅次于病虫害对作物造成的损失。解决干旱问题的途径，除了节水灌溉来提高水分的利用效率之外，就是培育节水抗旱的新品种以提高作物自身抵御干旱的能力。要达到这一目的，必须了解作物响应干旱胁迫的分子机制。因此，对作物抗旱机理的研究以探索提高作物抗旱能力是各国科学家关注的研究热点问题。尤其是近年来对拟南芥、水稻等模式植物的深入研究，已鉴定、克隆出大量耐旱相关的基因，已研究清楚了一些耐盐相关的基因的调控模式。将抗旱、耐盐基因通过基因工程的手段整合到目标植物基因组中或有目的的抑制或诱导一些干旱相关基因的表达来获得转基因植株，开辟了培育高度抗旱性作物新品种的新途径。随着对植物抗旱机理的了解以及转基因技术的日趋成熟，利用转基因技术来获得抗旱的育种材料或遗传改良的新品种，已成为抗旱品种培育最具发展潜力的方向。
[0004]NAC类转录因子在植物响应干旱等逆境胁迫中起重要的调控作用，直接参与或间接的调控植物对干旱、高盐等胁迫应答基因的表达，从而激活植物体内的抗逆反应，最大限度的降低或消除干旱等逆境对植物所造成的危害。水稻中研究发现，至少有5个NAC转录因子家族成员参与正向调控抗旱和抗盐胁迫反应，并且表达受ABA激素的调控。过量表达SNACl基因的转基因水稻表现为水分丧失速率明显减少，气孔关闭，抗旱性增强，结实率提高等特点。芯片分析发现大量与气孔运动、膜稳定性、渗透调节、解毒作用相关基因的表达明显增强。有研究也发现，过量表达0sNAC50、0NAC045和SNAC6/SNAC2的转基因水稻抗旱和抗高盐的能力显著提高，且胁迫相关基因的表达量也明显上调。同样有研究还发现0sNAC5和0sNAC6能与0sLEA3的启动子区序列结合。过量表达OsNAC1基因的转基因水稻对干旱、高盐的耐受性显著增强，且在干旱条件下能使水稻的产量增加25%?42%或在正常条件下增加5%?14%。将0NAC063基因转到拟南芥中，也可以增强植株增强抗旱抗盐能力。在拟南芥中，ATAFl基因功能丧失后，表达受抑制，抗旱能力明显提高，C0R47、KIN1、ERD10、RD22等抗旱相关基因的表达也增强，表明ATAFl基因通过调节胁迫反应基因的表达实现对抗旱反应起负调控作用；也有研究发现过量表达小麦基因TaNAC2的转基因拟南芥对干旱、高盐、和冷害的耐受性增强。同样，在烟草中过量表达TaNAC2的同源基因TaNAC2a，也可以增强转基因烟草对干旱的耐受性。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b的序列、stu-miR5992a和stu-miR5992b抑制靶基因表达以研究靶基因功能的应用、stu-miR5992a和stu-miR5992b抑制靶基因表达提高植物抗旱能力，培育抗旱植物品种的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下:
马铃薯stu-miR5992a的序列如下(本发明中所列核苷酸序列均为5,43,):cuuuuauugucugaagaugcaaguggaggaaaccugacuguaguuccuauuguuggaaugggcggugcggguaagacaacacuagcuaaagcgguuuacaaugaugagaag (序列表SEQ ID NO: I) 0
[0007]马铃薯 stu_miR5992b 的序列如下:uuauuaucugaagaugcaaguggaaaaaaguugacuguaguuucu
auuguuggaaugggcggcguggguaagacaacacuugcuaaagcgguuuacaaugaugagagggug(序列表SEQ ID NO:2)ο
[0008]马铃薯stu_miR5992a的序列的二级结构式为:自57端I lbp_17bp和84bp_90bp形成环状，自57端18bp_20bp和81bp_83bp形成环状，自57端23bp_26bp和75bp_78bp形成环状，自57端26bp_30bp和70bp_75bp形成环状，自57端39bp_41bp和57bp_60bp形成环状，自57端45bp-53bp形成环状，其他碱基配对形成茎环结构0
[0009]马铃薯stu_miR5992b的序列的二级结构式为:自57端3bp_6bp和54bp_57bp形成环状，自57端16bp_18bp和45bp_47bp形成环状，自57端19bp_23bp和40bp_44bp形成环状，自57端28bp-35bp形成环状，其他碱基配对形成茎环结构。
[0010]编码上述马铃薯stu-miR5992a的序列的DNA序列为:cttttattgtctgaagatgcaagtggaggaaacctgactgtagttcctattgttggaatgggcggtgcgggtaagacaacactagctaaagcggtttacaatgatgagaag(序列表SEQ ID N0:3)o
[0011]编码上述马铃薯stu-miR5992b序列的DNA序列为:ttattatctgaagatgcaagtggaaaaaagttgactgtagtttctattgttggaatgggcggcgtgggtaagacaacacttgctaaagcggtttacaatgatgagagggtg(序列表SEQ ID N0:4)o
[0012]上述马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b共同的成熟序列如下:aaagcgguuuacaaugaugag(序列表SEQ ID NO: 5)。该共同的成熟序列是stu_miR5992a自 5,端88bp-108bp的一段RNA序列；或者是stu_miR5992b序列自5,端85bp_105bp的一段RNA序列。
[0013]上述马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR5992a和stu-miR5992b抑制靶基因NAC类转录因子(PGSC0003DMG 400032555)的表达，所述NAC类转录因子基因序列如序列表SEQ ID N0:6所示。
[0014]上述马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b序列在培育抗旱转基因植物中的应用。
[0015]优选地，所述转基因植物为马铃薯(Solanum tuberosum) ο
[0016]优选地，在马铃薯中过表达SEQ ID NO:1所述miRNA，或者抑制SEQ ID NO:1所述miRNA的表达，培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯。
[0017]采用上述技术方案所产生的技术效果在于:本发明提供了一种马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b及其应用。RLM-5' RACE测检结果表明stu_miR5992a和stu-miR5992b调控NAC类转录因子(PGSC0003DMG400032555)表达，可用于研究该NAC类转录因子基因的功能，即通过缺失表达或过表达该NAC类转录因子时研究植物的生理生化变化。荧光定量PCR测检结果表明，stu-miR5992a和stu-miR5992b的表达受干旱胁迫调控，说明其在马铃薯适应干旱胁迫中起着重要作用，可利用其培育出具有高抗旱能力的转基因马铃薯，对提高马铃薯产量具有重要意义。
【附图说明】
[0018]图1是本发明马铃薯stu_miR5992a的二级结构图。
[0019]图2是本发明马铃薯stu-miR5992b的二级结构图。
[0020]图3是本发明马铃薯靶基因降解电泳图。
[0021]图4是本发明马铃薯靶基因降解组测序图。
[0022]图5是本发明马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b的荧光定量PCR图。
【具体实施方式】
[0023]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对【具体实施方式】进行详细说明。本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
[0024]在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，以下实施例仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。并且，本发明所使用的各种原料以及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得;所有定量试验均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0025]实施例一:stu-miR5992a和stu-miR5992b和靶基因序列的确认
马铃薯stu-miR5992a的序列如下(本发明中所列核苷酸序列均为5,43,):cuuuuauugucugaagaugcaaguggaggaaaccugacuguaguuccuauuguuggaaugggcggugcggguaagacaacacuagcuaaagcgguuuacaaugaugagaag (序列表SEQ ID NO: I) 0
[0026]马铃薯 stu_miR5992b 的序列如下:uuauuaucugaagaugcaaguggaaaaaaguugacuguaguuucu
auuguuggaaugggcggcguggguaagacaacacuugcuaaagcgguuuacaaugaugagagggug(序列表SEQ ID NO:2)ο
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