]如附图1所示，马铃薯stu_miR5992a的序列的二级结构式为:自57端llbp_17bp和84bp_90bp形成环状，自 57 端 18bp_20bp和81bp_83bp形成环状，自 57 端23bp_26bp和75bp-78bp形成环状，自 57 端26bp_30bp和70bp_75bp形成环状，自 57 端39bp_41bp和57bp_60bp形成环状，自5,端45bp-53bp形成环状，其他碱基配对形成茎环结构0
[0028]如附图2所示，马铃薯stu-miR5992b的序列的二级结构式为:自5,端3bp-6bp和54bp_57bp形成环状，自 57 端 16bp_18bp和45bp_47bp形成环状，自 57 端 19bp_23bp和40bp-44bp形成环状，自5,端28bp-35bp形成环状，其他碱基配对形成茎环结构。
[0029]编码上述马铃薯stu-miR5992a的序列的DNA序列为:cttttattgtctgaagatgcaagtggaggaaacctgactgtagttcctattgttggaatgggcggtgcgggtaagacaacactagctaaagcggtttacaatgatgagaagCj^^lJ^SEQ ID N0:3)o
[0030]编码上述马铃薯stu-miR5992b的序列的DNA序列为:ttattatctgaagatgcaagtggaaaaaagttgactgtagtttctattgttggaatgggcggcgtgggtaagacaacacttgctaaagcggtttacaatgatgagagggtg(序列表SEQ ID NO:4)。
[0031 ] 上述马铃薯stu_miR5992a和stu_miR5992b的共同的成熟序列如下:aaagcgguuuacaaugaugag(序列表SEQ ID NO: 5)。该共同的成熟序列是stu_miR5992a自 5'端88bp-108bp的一段RNA序列；或者是stu-miR5992b序列自5'端85bp_105bp的一段RNA序列。
[0032]上述马铃薯stu-miR5992a和stu-miR5992b的前体序列在研究基因功能中的应用，stu-miR5992a和stu-miR5992b抑制靶基因NAC类转录因子(PGSC0003DMG 400032555)的表达，所述NAC类转录因子基因序列如序列表SEQ ID N0:6所示。
[0033]实施例二:stu-miR5992a 和 stu-miR5992b 的制备1、马铃薯材料处理
选取大小均匀完整的马铃薯栽培品种“紫花白”和“大西洋”的薯块，然后将整薯盆栽种植于标准温室进行培养;每个品种平行种植六盆，当植株长到20厘米左右时，每个品种随机的选取3盆进行干旱处理，剩余的3盆按时浇水使其正常生长。当处理一月后。分别采集马铃薯干旱处理和对照植株新鲜的叶片，并立即在液态氮中速冻，被储存在-80°C冰箱。
[0034]2、样品总RNA提取与检测
(I)将采样的马铃薯叶片在液氮中快速研磨成粉末，在液氮尚未挥发之前将大约100mg的粉末立即转入预冷的DEPC处理过的1.5ml离心管中，快速加入Iml的Trizol溶液，涡旋震荡充分混勾后室温放置5?1min，使核酸与核蛋白完全分离。
[0035](2)4°C ,12000 r.min—1离心10 min，小心的将上清液转移到另一个DEPC处理过的1.5 ml离心管中。
[0036](3)加入200 μ?的氯仿，涡旋振荡混匀，室温放置5min。
[0037](4)4°C，12000 r.min—1离心10 min后，小心的将上层水相转移至另一个DEPC处理过的1.5ml离心管中，切记勿吸取中间有机相。
[0038](5)分离后加入相同体积的异丙醇，充分混勾再于室温放置15 min。
[0039](6)4°C ,12000 r.min-1 离心 10 min，废弃上清，可得到RNA沉淀;
(7)按2 ml 75%乙醇/ml Trizol的比例加入75%乙醇(DEPC水稀释)，温柔的振荡离心管，洗涤沉淀(重复一次)。
[0040](8)4°C ,12000 r.min—1离心5 min，弃掉上清，切不可倒出沉淀。
[0041](9)室温放置5?10 min自然干燥，注:RNA样品不要太过于干燥，否则很难再完全溶解。
[0042](10)用40 μ?无RNase的ddH20溶解RNA沉淀，55?60 °(:水浴处理5?10 min。将溶解好的RNA分装于1.5 mL无Rnase的离心管中，置于_80°C超低温冰箱保存。
[0043](Il)RNA样品的检测:琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop检测RNA的纯度(0D26Q/28()比值);Qubit对RNA浓度进行精确定量；Agilent 2100精确检测RNA的完整性。
[0044]3、miRNA文库的构建及测序
提取的RNA经检测合格后，分别使用small RNA Sample Pre Kit构建smRNA文库，利用smRNA的3'财端的特殊结构(5'端完整的磷酸基团，3'端有羟基)，使用RNA连接酶在纯化后的smRNA 37端加上接头，添加反转录引物，防止多余3'接头与5'接头连接，减少接头自连产物;再加5'接头，添加反转录酶将上述smRNA反转录成cDNA。随后用PCR扩增，然后扩增产物用PAGE胶电泳分离目标片段，切胶回收得到的为cDNA文库。以此cDNA文库为模板在11 Iumina测序仪中进行PCR扩增测序。miRNA分离、文库构建和高通量测序应用11 IuminaHiSeq 2500测序仪完成。
[0045]4、测序数据分析和miRNA筛选
将测序获得50 nt左右的序列经去除低质量的reads、去除5'接头污染的reads、去除没有3'接头序列的reads以及含有poIyA的reads，获得clean reads数据。将clean reads与genbank和Rf am数据库以及参考基因组进行比对，获得不同sRNA的注释信息。然后进行序列长度分布统计以及样品之间公共序列统计分析，miRNA主要集中在20-24 nt的范围。除注释的所有miRNA片段，选取剩下的未注释miRNA片段进行已知miRNA的鉴定和新miRNA的预测分析。
[0046]miRNA转录起始位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向互补序列上，其前体具有标志性的发夹结构，成熟体的形成是由Dicer酶的剪切实现的。针对miRNA的生物特征，对于比对到参考基因组上的序列，利用miRDeep2软件进行已知及新的miRNA鉴定。由于不同物种在各个长度中miRNA所占百分比也有差异，故我们以长度为条件进行分类统
i+o
[0047]前体miRNA(pre-miRNAs)在Exportin-5帮助下转运到细胞核外，由细胞质Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs，酶切位点的特异性使得miRNA成熟体序列首位碱基对于碱基U具有很强的偏向性，另外其他的位点也有一些统计，如:2?4号位一般缺少U，第10号位偏向于A (第1号位一般是miRNA对其靶基因发生剪切作用时的剪切位点)。
[0048]对于miRNA其前体序列能够形成发夹结构是其最具标志性特征之一。通过截取一定长度sRNA能够比对在基因组上的序列，利用miRDeep2软件对一定长度的序列其二级结构、分析Dicer酶切位点和计算自由能，如果能够满足miRNA的要求，贝Ij为马铃薯中候选的新miRNA。具体应符标准为:(I)截取的一定长度的序列能够折叠成一个发夹结构的二级结构；(2) miRNA的成熟序列应在发夹结构的一条臂上；(3) miRNAs成熟序列与另一个臂上的miRNA*序列的错配应小于6个碱基；(4) miRNAs成熟序列和miRNA*序列不能形成环状结构或发生断裂；(5) 二级结构有较低的MFEs值和较高的MFEIs值，且A+U的含量应高与C+G的含量。
[0049]通过RNA合成技术，例如MALD1-TOF(matrix-assisted laser desorpt1n1n izati on-time-off light)合成，并通过HPLC对产物RNA进行纯度分析，即能得到所述stu_miR5992a 和 stu_miR5992b 产品。
[0050]实施例三:stu-miR5992a和 stu-miR5992b 的应用
l、miRNA靶基因预测
利用stu-miR599 2a和stu-miR599 2b和马铃薯基因mRNA序列信息文件，通过TargetFinder软件进行革El基因预测。miRNA革El基因预测规则为:
(1)sRNA与靶基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配)；
(2)在miRNA/靶基因复合体中，不得有超过2处发生相邻位点的错配； (3)在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5'端起第2?12个位点不得有相邻位点都发生错配；
(4)miRNA/靶基因复合体的第10?11个位点不得发生错配；
(5)在miRNA/靶基因复合体中，从mi端起第I?12个位点不得有超过2.5个错配
，
(6)miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75% 。
[0051 ] 2、采用RLM-5' RACE验证stu_miR5992a和stu_miR5992b的靶基因
(1)5'端接头的连接
RLM-57 RACE反应使用Invitrogen公司的GeneRaeer试剂盒进行。首先用T4 RNA连接酶将一段 RNA 接头序列(GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUG
AAA)直接连接在10ng的总RNA 57末端，在冰上配制反应液，充分混匀，短暂离心，然后37°C孵化I小时，用于反转录合成cDNA。接头反应体系为:总RNA 2yL,5/RACE Adapter I μL,10 XRNA Ligase buffer I yL，T4 RNA Ligase(2.5U/yL) 2 yL,NucIease-free Wate 4yL0