CC和TTCTGGGGT)、同时整合了 UASGal4pBS的启动子突变体。其中序列表中 序列5自5'末端起第1至178位为UASGal4pBS，第185至630位为敲除两个阻遏蛋白Miglp结合 位点的启动子序列(命名为GALlpAm2)。
[0141 ] 二、组成型顺式调控元件RRPE和PAC的整合
[0142] 1、根据GenBank中酿酒酵母核糖体形成相关基因启动子区的顺式调控元件RRPE和 顺式调控元件 PAC 的序列（GenBankID:NC-001142.9 (438771-438799)，RRPE 的序列为 AAAAATTTT，PAC的序列为GCGATGAGC)以及实施例2步骤一 (2)的PCR扩增产物的测序结果，设 计并人工合成引物13:
[0143] 5 '-CCGGAATTCCTCAAAAATTTTACGCCCGCGATGAGCAGCGCATGCCCGCGGTGCTCATTGCTATAT -3'（划线部分为限制性内切酶EcoRI的识别位点）。
[0144] 2、以实施例2步骤一(2)的PCR扩增产物为模板，以步骤1合成的引物13和实施例2 步骤一（1)合成的引物8为引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约226bp的PCR 扩增产物。
[0145] 3、用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤2获得PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0146] 4、用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤一构建的重组质粒YCp-UGGAA m2， 回收约9310bp的载体骨架。
[0147] 5、将步骤3获得的酶切产物和步骤4获得的载体骨架用T4DNA连接酶连接，得到重 组质粒 YCp-URpGGAAm2。
[0148] 根据测序结果，对重组质粒YCp-URpGGAAm2进行结构描述如下：向重组质粒YCp-UGGA Δ m2的限制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序 列6所示的DNA分子。序列表中序列6所示的DNA分子即为整合了顺式调控元件RRPE、顺式调 控元件PAC、UASGal4pBS和GALlpAm2的启动子突变体。其中序列表中序列6自5'末端起第4 至12位为顺式调控元件RRPE的序列，第19至27位为顺式调控元件PAC的序列，第31至208位 为 UASGal4pBS，第215至660位为 GALlpAm2。
[0149] 二、酵母菌转化
[0150] 按照实施例1步骤二的方法，将重组质粒YCp-GA替换为重组质粒YCp-UGGA Δ m2，其 它步骤均相同，获得重组酵母菌，命名为YS58-UGGA Δ m2。
[0151] 按照实施例1步骤二的方法，将重组质粒YCp-GA替换为重组质粒YCp-URPGGA Δ m2， 其它步骤均相同，获得重组酵母菌，命名为YS58-URPGGAΔm2。
[0152] 三、绿色荧光蛋白表达水平分析
[0153] 实验重复三次，结果取平均值。实验步骤如下：
[0154] 1、按照实施例1步骤三的方法，测定YS58-GGA的比荧光强度。
[0155] 2、按照实施例1步骤三的方法，将YS58-GGA分别替换为YS58-UGGA、YS58-UGGAAm2 和YS58-URPGGA Δ m2，待测培养基甲替换为待测培养基丙，得到相应的比荧光强度。所述待测 培养基丙为含1% (质量百分比）半乳糖的酵母菌液体培养基、含2% (质量百分比）半乳糖的 酵母菌液体培养基、含1 % (质量百分比）半乳糖和0.5 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体 培养基、含1 % (质量百分比)半乳糖和1 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基、含2 % (质量百分比)半乳糖和0.5% (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基、或、含2% (质量百 分比)半乳糖和1% (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基。
[0156] 将YS58-GGA在含1%半乳糖的酵母菌液体培养基中培养5h时的比荧光强度定为1， YS58-GGA、YS58-UGGA、YS58-UGGA Δ m2或YS58-UrpGGA Δ m2在各培养基中培养5h时的比荧光 强度见表2。
[0157] 结果表明，敲除GALlp启动子中的两个阻遏蛋白结合序列，同时整合了酵母转录因 子Gal4结合位点的序列，得到的启动子的半乳糖诱导强度比没有敲除阻遏蛋白结合序列的 启动子略有降低，但可以在一定程度上弱化葡萄糖阻遏效应;在此基础上，再整合顺式调控 元件RRPE和顺式调控元件PAC，得到的启动子虽然半乳糖诱导强度比没有整合顺式调控元 件RRPE和顺式调控元件PAC的启动子有所降低，但葡萄糖阻遏效应则明显降低，在葡萄糖存 在下启动子仍然可以有效启动基因的表达。结果表明，可以依据培养条件选择不同的启动 子实现目标基因表达水平的理性调控。
【主权项】
1. 特异DNA分子甲，为DNA分子I、DNA分子Π 、DNA分子m、DNA分子IV或DNA分子V ; 所述DNA分子I自上游至下游依次包括:RREP区段、PCA区段、UASGal4pBS区段和GALlpA m2区段； 所述DNA分子Π 自上游至下游依次包括:所述RREP区段、所述UASGal4pBS区段和所述 GALlpAm2 区段； 所述DNA分子ΙΠ 自上游至下游依次包括：所述PCA区段、所述UASGal4pBS区段和所述 GALlpAm2 区段； 所述DNA分子IV自上游至下游依次包括:所述UASGal4pBS区段和所述GALlpAm2区段； 所述DNA分子V自上游至下游依次包括:所述UASGal4pBS区段和GALlp区段； 所述RREP区段为顺式调控元件RRPE;所述PCA区段为顺式调控元件PAC;所述 UASGal4pBS区段为酵母转录因子Gal4结合位点的序列;所述GALlpAm2区段为敲除GALlp启 动子中的两个阻遏蛋白结合序列的序列;所述GALlp区段为编码GALlp启动子的序列。2. 如权利要求1所述的特异DNA分子甲，其特征在于： 所述RREP区段为序列表中序列6自5'末端起第4至12位所示的DNA序列； 所述PCA区段为序列表中序列6自5'末端起第19至27位所示的DNA序列； 所述UASGal4pBS区段为序列表中序列6自5'末端起第31至208位所示的DNA序列； 所述GALlpAm2区段为序列表中序列6自5'末端起第215至660位所示的DNA序列； 所述GALlp区段为序列表中序列4自5'末端起第185至648位所示的DNA序列。3. 如权利要求1或2所述的特异DNA分子甲，其特征在于： 所述DNA分子I为如下a 1)或a2)或a3)所不的DNA分子： al)核苷酸序列是序列表中序列6所示的DNA分子； a2)与al)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子； a3)在严格条件下与al)或a2)限定的核苷酸序列杂交的DNA分子； 所述DNA分子IV为如下dl)或d2)或d3)所不的DNA分子： dl)核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子； d2)与dl)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子； d3)在严格条件下与dl)或d2)限定的核苷酸序列杂交的DNA分子； 所述DNA分子V为如下el)或e2)或e3)所不的DNA分子： el)核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子； e2)与el)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性的DNA分子； e3)在严格条件下与el)或e2)限定的核苷酸序列杂交的DNA分子。4. 特异DNA分子乙，自上游至下游依次包括:权利要求1至3任一所述特异DNA分子甲和 ADHlt区段； 所述ADHlt区段为序列表中序列1所示的DNA分子。5. 含有权利要求1至3任一所述特异DNA分子甲的重组质粒甲。6. 含有权利要求4所述特异DNA分子乙的重组质粒乙。7. 权利要求1至3任一所述特异DNA分子甲、权利要求4所述特异DNA分子乙、权利要求5 所述重组质粒甲或权利要求6所述重组质粒乙在启动目的基因表达中的应用。8. -种表达目的基因的方法，包括如下步骤:采用权利要求1至3任一所述特异DNA分子 甲启动目的基因的表达。9. 一种表达目的基因的方法，包括如下步骤:将目的基因插入权利要求5所述重组质粒 甲中的所述特异DNA分子甲的下游，由所述特异DNA分子甲启动所述目的基因的表达。 10. A1)或A2): A1)-种表达目的基因的方法，包括如下步骤:将目的基因插入权利要求4所述特异DNA 分子乙中的所述特异DNA分子甲和所述ADHlt区段之间，由所述特异DNA分子甲启动所述目 的基因的表达； A2)-种表达目的基因的方法，包括如下步骤:将目的基因插入权利要求6所述重组质 粒乙中的所述特异DNA分子甲和所述ADHlt区段之间，由所述特异DNA分子甲启动所述目的 基因的表达D
【专利摘要】本发明公开了一种调节启动子强度和/或表达模式的特异DNA分子。本发明提供的特异DNA分子由RREP区段和/或PCA区段和/或UASGal4pBS区段和/或GAL1p△m2区段和/或ADH1t区段和/或GAL1p区段组成。所述RREP区段、所述PCA区段、所述UASGal4pBS区段和所述GAL1p△m2区段的核苷酸序列依次如序列6自5′末端起第4至12位、第19至27位、第31至208位和第215至660位所示，所述GAL1p区段和所述ADH1t区段的核苷酸序列依次为序列4自5′末端起第185至648位和序列1所示。所述特异DNA分子可调节启动子强度和/或表达模式，实现启动子的多样化。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/63
【公开号】CN105647924
【申请号】
【发明人】何秀萍, 刘莎, 郭雪娜, 王肇悦
【申请人】中国科学院微生物研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月29日