A分子甲启动所述目的基因的 表达。
[0059]上述方法中，所述目的基因具体可为绿色荧光蛋白的编码基因。所述绿色荧光蛋 白的编码基因可如序列表中的序列2所示。
[ΟΟ?Ο] 实验证明，在GALlp启动子（由所述GALlp区段编码)上游增加酵母转录因子Gal4p 的结合序列，可增强GALlp启动子的诱导敏感性;敲除GALlp启动子中的两个阻遏蛋白结合 序列，同时整合了酵母转录因子Gal4结合位点的序列，得到的启动子的半乳糖诱导强度比 没有敲除阻遏蛋白结合序列的启动子略有降低，但可以在一定程度上弱化葡萄糖阻遏效 应;在此基础上，再整合顺式调控元件RRPE和顺式调控元件PAC，得到的启动子虽然半乳糖 诱导强度比没有整合顺式调控元件RRPE和顺式调控元件PAC的启动子有所降低，但葡萄糖 阻遏效应则明显降低，在葡萄糖存在下启动子仍然可以有效启动基因的表达。上述结果表 明，可以依据培养条件选择不同的启动子实现目标基因表达水平的理性调控。可见，利用本 发明提供的所述特异DNA分子甲或所述特异DNA分子乙可以调节启动子强度和/或表达模 式，从而可以依据培养条件选择不同的启动子实现目标基因表达水平的理性调控。总之，对 启动子主要功能区进行理性设计和改造，可实现启动子强度和表达模式的多样化，从而满 足对酵母菌代谢工程改造的现实需要。
【具体实施方式】
[0061] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0062] 下述实施例中所用限制性内切酶和T4-DNA连接酶均购自TaKaRa公司，Q5超保真 DNA聚合酶购自NEW ENGLAND Biolabs公司。
[0063] 酿酒酵母YS58记载于如下文献中：Teunissen AW，Holub E，van den Hucht J，van der Berg J，Steensma HY. Sequence of the FLOlgene from Saccharomyces cerevisiae.Yeast，1993,9:423-427.，公众可以从中国科学院微生物研究所获得。
[0064] 穿梭载体YCp50记载于如下文献中：Rose MD，Novick 0，Thomas JH，Botstein D， Fink GR.A Saccharomyces cerevisiae genomic plasmid bank based on a centromer-containing shuttle vector.Gene，1987,60:237_243.，公众可以从中国科学院微生物研 究所获得。
[0065] 质粒pGEM-T-GFP记载于如下文献中：Li E，Yue F，Chang Q，Guo X，He X，Zhang B.Deletion of intragenic tandem repeats in unit C of FLOlof Saccharomyces cerevisiae increases the conformational stabil ity of floccul in under acidic and alkal ine conditions.PLoS 0ne，2013,8:e53428.，公众可以从中国科学院微生物研 究所获得。
[0066] 酵母菌液体培养基：将Yeast Nitrogen Base6.3g、40mg组氨酸、40mg色氨酸和 40mg亮氨酸溶于1L蒸馏水。
[0067] 酵母菌固体培养基：将10g葡萄糖、Yeast Nitrogen Base6.3g、40mg组氨酸、40mg 色氨酸、40mg亮氨酸和10g琼脂粉溶于1L蒸馏水，121°C高压灭菌15min后，得到的培养基。
[0068]酵母菌筛选平板:将酵母菌固体培养基趁热倒入培养皿中，得到酵母菌筛选平板。
[0069]实施例l、GALlp启动子调控绿色荧光蛋白编码基因的表达
[0070] 一、表达载体的构建
[0071] 1、重组质粒YCp-ADHlt的构建
[0072] (1)根据GenBank中酿酒酵母乙醇脱氢酶基因 1 (Alcohol dehydrogenase 1，ADH1) 的终止子序列（GenBankID:Z74828.1)，设计并人工合成引物1:5^ CCCGAGCTCATTCGCTTAAAGAATAC-37 (划线部分为限制性内切酶SacI的识别位点）和引物2: 57 -ACGCGTCGACGGCCATCTCCACACCAG-37 (划线部分为限制性内切酶Sail的识别位点）。
[0073] (2)提取酿酒酵母YS58的总DNA并以此为模板，以步骤（1)合成的引物1和引物2为 引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0074] 反应条件:98°C变性30s;98°C变性10s，55°C退火30s，72°C延伸98,30个循环 ;72°〇 延伸2min。
[0075] (3)用限制性内切酶Sac I和Sal I双酶切步骤(2)获得PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0076] (4)用限制性内切酶SacI和Sail双酶切穿梭载体YCp50,回收约7950bp的载体骨 架。
[0077] (5)将步骤(3)获得的酶切产物和步骤(4)获得的载体骨架用T4DNA连接酶连接，得 到重组质粒YCp-ADHlt。
[0078] 根据测序结果，对重组质粒YCp-ADHlt进行结构描述如下：向穿梭载体YCp50的限 制性内切酶SacI和Sail的酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分 子。序列表中的序列1所示的DNA分子为终止子。
[0079] 2、重组质粒YCp-GA的构建
[0080] (1)根据GenBank中绿色荧光蛋白（GFP)编码基因（GenBankID:NC_011521.1)的核 苷酸序列，设计并人工合成引物3:5' -CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAA-37 (划线部分为限制 性内切酶BamHI的识别位点）和引物4:5' -CCCGAGCTCTTATTTGTATAGTTCATCC-37 (划线部分为 限制性内切酶SacI的识别位点）。
[0081 ] (2)以质粒PGEM-T-GFP为模板，以步骤（1)合成的引物3和引物4为引物，利用Q5超 保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0082] 反应条件：98°C变性30s ; 98 °C变性10s，55°C退火30s，72 °C延伸25s，30个循环；72 °C 延伸 2min。
[0083] (3)用限制性内切酶BamH I和Sa c I双酶切步骤（2)获得P CR扩增产物，回收酶切产 物。
[0084] (4)用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切步骤1构建的重组质粒YCp-ADHl t，回收约 8140bp的载体骨架。
[0085] (5)将步骤(3)获得的酶切产物和步骤(4)获得的载体骨架用T4DNA连接酶连接，得 到重组质粒YCp-GA。
[0086] 根据测序结果，对重组质粒YCp-GA进行结构描述如下：向重组质粒YCp-ADHlt的限 制性内切酶BamHI和SacI的酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列2所示的DNA分 子。编码绿色荧光蛋白（GFP)的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。
[0087] 3、重组质粒YCp-GGA的构建
[0088] (1)根据GenBank中酿酒酵母GAL1基因序列（GenBankID:X76078.1)，设计并人工合 成引物5:5' -CCCCAAGCTTTGCTCATTGCTATAT-37 (划线部分为限制性内切酶Hindm的识别位 点）和引物6:5' -CGCGGATCCCTCCTTGACGTTAAAGTA-37 (划线部分为限制性内切酶BamHI的识 别位点）。
[0089] (2)提取酿酒酵母YS58的总DNA并以此为模板，以步骤（1)合成的引物5和引物6为 引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0090] 反应条件：98°C 变性 3〇8;98°(：变性1〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸158,30个循环；72 °C 延伸 2min。
[0091] (3)用限制性内切酶Hindm和BamHI双酶切步骤(2)获得PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0092] (4)用限制性内切酶Hindm和BamHI双酶切步骤2构建的重组质粒YCp-GA，回收约 8850bp的载体骨架。
[0093] (5)将步骤(3)获得的酶切产物和步骤(4)获得的载体骨架用T4DNA连接酶连接，得 到重组质粒YCp-GGA。
[0094] 根据测序结果，对重组质粒YCp-GGA进行结构描述如下：向重组质粒YCp-GA的限制 性内切酶Hindm和BamHI的酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列3所示的DNA分 子。序列表中的序列3所示的DNA分子为GALlp启动子的核苷酸序列，命名为GALlp。
[0095] 二、酵母菌转化
[0096] 将步骤一中2构建的重组质粒YCp-GA通过电转化法（电转条件：1.5kV，50yF，200 Ω，3mSec)导入酿酒酵母YS58，然后涂布在酵母菌筛选平板上，通过尿嘧啶营养缺陷互补筛 选，得到重组酵母菌，命名为YS58-GA。
[0097]按照上述方法，将重组质粒YCp-GA替换为重组质粒YCp-GGA，其它步骤均相同，获 得重组酵母菌，命名为YS58-GGA。
[0098]三、绿色荧光蛋白表达水平分析
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