9]实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：
[0100] 1、将YS58-GGA单克隆接种于5mL含1%葡萄糖的酵母菌液体培养基，30°C、200rpm 震荡培养16h后，5000rpm离心5min，收集细胞，先用无菌水洗涤2次，再接种于5mL待测培养 基甲，30°C、200rpm培养15h。所述待测培养基甲为含0.5% (质量百分比）半乳糖的酵母菌液 体培养基、含1% (质量百分比）半乳糖的酵母菌液体培养基、含2% (质量百分比）半乳糖的 酵母菌液体培养基、含0.5 % (质量百分比)半乳糖和0.5 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液 体培养基、含0.5 % (质量百分比）半乳糖和1 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基、 含1 % (质量百分比)半乳糖和〇. 5 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基、含1 % (质量 百分比）半乳糖和1% (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基、含2% (质量百分比）半乳 糖和0.5 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基、或、含2 % (质量百分比）半乳糖和1 % (质量百分比）葡萄糖的酵母菌液体培养基。
[0101] 培养过程中，每隔5小时取样2mL，进行如下实验:6000rpm离心5min，收集细胞，将 收集的细胞先用pH7.4、0.2M磷酸缓冲液洗涤两次，然后用lmL pH7.4、0.2M磷酸缓冲液悬 浮，得到悬浮液;吸取l〇〇yL所述悬浮液至96孔板，用TECAN高通量多功能读板仪/酶标仪(型 号Tecan Infinite 200PR0)检测YS58-GGA的GFP荧光强度值(激发波长:488nm，接受波长： 509nm)和YS58-GGA的600nm处的吸光值(0D二值）。
[0102] 2、按照上述步骤1的方法，将YS58-GGA单克隆替换为YS58-GA单克隆，其它步骤均 不变，得到YS58-GA的GFP荧光强度值和YS58-GA的600nm处的吸光值。
[0103] 3、完成步骤1和步骤2后，计算比荧光强度(RFU)，从而表征GFP的表达水平：
[0104] 比荧光强度=(YS58-GGA的荧光强度值/YS58-GGA的0D6QQr?值)-(YS58-GA的GFP荧 光强度值/YS58-GA的0D 6Q(U直）。
[0105] 实验结果见表1，结果表明，YS58-GGA只有在半乳糖诱导下才能检测到绿色荧光蛋 白的表达，当培养基中存在不同浓度的葡萄糖时，半乳糖对绿色荧光蛋白的诱导表达完全 被抑制。而且，只有在半乳糖浓度大于1%时才能有效诱导蛋白的表达。
[0106] 表1.不同诱导培养条件下YS58-GGA的绿色荧光蛋白表达水平
[0107]
[0108] 实施例2、GALlp启动子改造提高诱导强度和敏感度
[0109] 一、重组质粒YCp-UGGA的构建
[0110] (1)根据GenBank中酿酒酵母GAL1基因序列(GenBankID:X76078.1)，设计并人工合 成引物7 : 5' -CCGGAATTCGCATGCCCGCGGTGCTCATTGCTATAT-3'(划线部分为限制性内切酶 EcoRI的识别位点）和引物8:5' -CCCAAGCTTGCTAGTATTGTAGAATC-37 (划线部分为限制性内切 酶Hindm的识别位点）。
[0111] (2)以实施例1步骤一中3 (2)获得PCR扩增产物为模板，以步骤（1)合成的引物7和 弓丨物8为引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
[0112] (3)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切步骤(2)获得PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0113] (4)用限制性内切酶EcoRI和Hindm双酶切实施例1步骤一中3构建的重组质粒 YCp-GGA，回收约9330bp的载体骨架。
[0114] (5)将步骤(3)获得的酶切产物和步骤(4)获得的载体骨架用T4DNA连接酶连接，得 到重组质粒YCp-UGGA。
[0115] 根据测序结果，对重组质粒YCp-UGGA进行结构描述如下：向重组质粒YCp-GGA的限 制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列4所示的DNA 分子。序列表中的序列4自5'末端起第1至178位为酵母转录因子Gal4结合位点的序列(命名 为UASGal4pBS)，第 185至648位为GALlp。
[0116] 二、酵母菌转化
[0117] 按照实施例1步骤二的方法，将重组质粒YCp-GA替换为重组质粒YCp-UGGA，其它步 骤均相同，获得重组酵母菌，命名为YS58-UGGA。
[0118]三、绿色荧光蛋白表达水平分析
[0119]按照实施例1步骤三的方法，将YS58-GGA替换为YS58-UGGA，待测培养基甲替换为 待测培养基乙，其它步骤均不变，得到YS58-UGGA的比荧光强度(RFU)。所述待测培养基乙为 含0.5% (质量百分比）半乳糖的酵母菌液体培养基、含1% (质量百分比)半乳糖的酵母菌液 体培养基或含2% (质量百分比)半乳糖的酵母菌液体培养基。
[0120]将YS58-GGA在含1%半乳糖的酵母菌液体培养基中诱导5h的GFP表达水平作为1。
[0121] 实验结果表明，YS58-UGGA在含1 %半乳糖的酵母菌液体培养基中培养5h时的比荧 光强度比YS58-GGA提高了46% (表2)，YS58-UGGA在含2%半乳糖的酵母菌液体培养基中培 养5h时的比荧光强度比YS58-GGA提高了 81%(表2)，可见，在641^1?启动子上游增加酵母转 录因子Gal4p的结合序列，可使GALlp启动子诱导强度明显提高;YS58-GGA在含0.5%半乳糖 的酵母菌液体培养基中培养5h时，检测不到绿色荧光蛋白的表达，但YS58-UGGA在含0.5% 半乳糖的酵母菌液体培养基中培养5h时的比荧光强度与YS58-GGA在含1 %半乳糖的酵母菌 液体培养基中培养15h时的比荧光强度基本相当(表1)，可见，在GALlp启动子上游增加酵母 转录因子Gal4结合位点的序列，可增强GALlp启动子的诱导敏感性。
[0122] 表2.不同启动子的半乳糖诱导效应及葡萄糖阻遏效应比较
[0123]
[0124] 实施例3、GALlp启动子改造突破GALlp启动子的葡萄糖阻遏效应
[0125 ] -、敲除GAL1 p启动子中的阻遏蛋白结合位点
[0126] 1、根据GenBank中酿酒酵母GAL1基因序列(GenBankID:X76078.1)，设计并人工合 成引物9、引物10、引物11和引物12。
[0127] 引物9:5' -TTGATTCGTTCATTTGAAGGCCAGGTTACTGCCAATTTTT-3';
[0128] 引物10:5' -AAAAATTGGCAGTAACCTGGCCTTCAAATGAACGAATCAA-3';
[0129] 引物11:5' -ATCGCTTCGCTGATTAATTATAAGGCTAAAAAACTAATCG-3';
[0130] 引物12:5' -CGATTAGTTTTTTAGCCTTATAATTAATCAGCGAAGCGAT-3' 〇
[0131] 2、以实施例2中构建的重组质粒YCp-UGGA为模板，以实施例2中合成的引物7和步 骤1中合成的引物9为引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约418bp的PCR扩增 产物1;以实施例2中构建的重组质粒YCp-UGGA为模板，以实施例1中步骤一中3合成的引物6 和步骤1中合成的引物10为引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约279bp PCR 扩增产物2。
[0132] 3、将步骤2中的PCR扩增产物1和PCR扩增产物2等质量混合，得到混合溶液。
[0133] 4、以步骤3的获得的混合溶液为模板，以步骤2中所述引物6和所述引物7为引物， 利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约657bpPCR扩增产物。该PCR扩增产物即为敲除 第一个阻遏蛋白Miglp结合位点（核苷酸序列为CCACAAACC)的GALlp启动子突变体，命名为 GALlp Aml-UAS〇
[0134] 5、以步骤4获得的GALlp Δ ml-UAS为模板，以实施例2中合成的引物7和步骤1中合 成的引物11为引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约491bp的PCR扩增产物3; 以步骤4获得的GALlp Aml-UAS为模板，以实施例1中步骤一中3合成的引物6和步骤1中合成 的引物12为引物，利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约206bp PCR扩增产物4。
[0135] 6、将步骤5中的PCR扩增产物3和PCR扩增产物4等质量混合，得到混合溶液。
[0136] 7、以步骤6的获得的混合溶液为模板，以步骤2中所述引物6和所述引物7为引物， 利用Q5超保真DNA聚合酶进行PCR扩增，回收约648bp的PCR扩增产物。
[0137] 8、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤7获得的PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0138] 9、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切实施例1步骤一中2构建的重组质粒YCp-GA，回收约8850bp的载体骨架。
[0139] 10、将步骤8获得的酶切产物和步骤9获得的载体骨架用T4DNA连接酶连接，得到重 组质粒 YCp-UGGAAm2。
[0140] 根据测序结果，对重组质粒YCp-UGGAAm2进行结构描述如下：向重组质粒YCp-GA 的限制性内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列5所示的 DNA分子。序列表中序列5所示的DNA分子即为敲除两个阻遏蛋白Miglp结合位点（核苷酸序 列分别为CCACAAA