NaOH缓冲液和Ca(N03) 2溶液等量混合而成，其中甘氨 酸-NaOH缓冲液的配方为:甘氨酸3 · 75g/L、甘露醇15g/L，并使用0 · 2mol/LNa0H溶液调pH至 9-10 · 5; Ca(N03)2溶液的浓度为 94 · 4g/L。
[0068] 本发明葡萄原生质体融合的照片如图2所示。
[0069] 4.融合体细胞的培养
[0070] 将融合后的杂种细胞，加入KMsP液体培养基调节密度至1 X 105个· ml/1，以KMsP为 基本培养基，采用低熔点琼脂糖固体包埋的方法培养原生质体，封口膜封口后在培养箱中 25°C恒温暗培养。由胚性愈伤组织分离的原生质体在KM 8P培养基上6-7d左右原生质体复 壁，14-15d左右出现第一次分裂，20-25d出现第二次分裂，65-70d左右出现肉眼可见小愈伤 组织。葡萄原生质体培养的照片如图3所示。
[0071 ] 5.再生胚性愈伤组织胚状体的诱导
[0072] 逐步、即时将再生胚性愈伤组织颗粒转接至分化培养基MS+6-BA 0. lmg · L-bNAA 0. lmg · Γ1上诱导胚状体，在25°C下暗培养2周后移置光照强度为1000-15001x下培养，照光 1周后生出不定芽，再将不定芽转接到生根培养基1/2MS+NAA l.Omg.L-blBA 0.5mg.L一1 上培养。葡萄胚性愈伤组织体细胞胚的照片如图4所示。
[0073] 6.炼苗与移栽
[0074]当组培苗长到5~7cm，且根系生长旺盛时，将组培苗放在炼苗室中进行炼苗6~ 9d，开瓶炼苗分阶段进行，即首先松盖2~3d，然后部分开盖2~3d，最后完全揭去盖。逐步使 试管苗适应温室环境，以防止叶片萎蔫。用镊子轻轻将试管苗从瓶中取出，放在水中彻底清 除根部的培养基，然后用〇. 1%的多菌灵浸泡根部10~30min后，移入经灭菌后的基质中。移 栽后浇透水，喷施除去有机物的1/2MS营养液，并附上塑料膜保持相对湿度。在移入基质后 的第5d、10d、15d、20d去掉附上的塑胶膜进行敞开炼苗，并在相同条件下取小苗的叶片，观 察叶片的气孔大小。移栽前期用除去有机物的1/2MS对小苗进行喷雾，当小苗茎杆颜色加 深，叶片油亮时或长出新叶后用自来水浇灌。葡萄原生质体经融合获得的杂种植株照片如 图5所示。炼苗过程见图6。
[0075] 本发明实施例涉及的CPW溶液配方:磷酸二氢钾27.2mg/L、硝酸钾101.0mg/L、二水 合氯化1丐1480 · Omg/L、七水合硫酸镁246 · Omg/L、碘化钾0 · 16mg/L、五水合硫酸铜0 · 025mg/ L〇
[0076]本发明实施例涉及到的主要培养基如表6所示；所使用的主要试剂有a-萘乙酸 (NAA)、6_苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸（IBA)、盐酸(HCL)、氢氧化钠(NaOH)、琼脂、无水乙 醇、甘露醇、甘露醇、磷酸二氢钾(KH 2P〇4)、硝酸钾、二水氯化钙、七水硫酸镁、碘化钾、五水硫 酸铜、蔗糖、硼酸、肌醇、叶酸、柠檬酸、苹果酸、生物素、水解酪蛋白、纤维素酶(Cellulase)、 离析酶(Macerozyme)、果胶酶(Pectolyase)、2-(N_吗啡啉）乙磺酸、低恪点琼脂糖、聚乙二 醇6000(PEG)、甘氨酸、Ca(N0 3)2 · 4H20、碘乙酰胺（Ι0Α)等;所使用的主要仪器有高压蒸汽灭 菌锅、雷磁Phs-3c精密pH计、电子分析天平、超净工作台、微量移液器(Eppendorf)、人工气 候箱、水浴冷冻恒温振荡器(LSHE-300D)、普通光学显微镜(OLYMPUS Dp70.)、倒置显微镜 (Nikon MODEL C-LEDS)、荧光倒置显微镜(Nikon ECLIPSE Ti-S)、血球计数板、细胞筛、低 速离心机(TDL-40B)等;其他用到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合原生质 体不对称融合技术领域的市售产品。
[0077]以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应 属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都 应认为是包括在权利要求书的范围内。
[0078] 表6MS和KMsP培养基配方(mg/L)
【主权项】
1. 一种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其特征在于包括以下 操作步骤： (1) 原生质体的分离和纯化:取新鲜的胚性愈伤组织加酶液，在26-28Γ、黑暗条件下， 60-70r/min振荡酶解2-12h，然后分离纯化得到葡萄原生质体； (2) 原生质体的的钝化处理： (a) IOA钝化：取步骤（1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为 0.5-1 X 105个/mL的悬浮液，然后加入1:5配比的4.0-8. Ommol/L碘乙酰胺溶液钝化处理9-llmin，处理完后使用CPW溶液洗涤2-3遍，用KMsP液体培养基悬浮，将原生质体密度调整为 0.5-1 X 105个/mL，得到受体原生质体； (b) UV钝化:取步骤（1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为0.5-1X105个/mL的悬浮液，在1250-1350yW/cm 2紫外光照强度下照射0.5-16min，得到供体原生 质体； (3) 原生质体的融合:将步骤(3)(a)得到的受体原生质体和步骤(3)(b)得到的供体原 生质体按1:1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1-4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导液，在 25-30°C下保温15-30min，再加入2-4倍亲本悬浮液体积的高Ca 2+-高pH溶液，混合后在25-30 °C下保温10_15min，然后使用CPW溶液洗涤2-3遍，离心得到融合的杂种细胞； (4) 融合体细胞的培养:使用KMsP固体培养基包埋培养步骤(3)得到的融合杂种细胞，在 25-27Γ、黑暗条件下静置培养，直至长出再生胚性愈伤组织颗粒； (5) 再生胚性愈伤组织胚状体的诱导：将再生胚性愈伤组织颗粒转接至分化培养基上 诱导胚状体，直至长出不定芽，再将不定芽转接到生根培养基上培养； (6) 炼苗与移栽：当组培苗长到5-7cm、且根系生长旺盛时，将组培苗移栽入炼苗室中进 行炼苗，即得到体细胞杂种植株。2. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述步骤（1)中酶液的配方为：2.50 %纤维素酶、0.25 %果胶酶、0.25 %离析酶、 0.40mol/L甘露醇、0.1%MES，pH 5.8。3. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述步骤(1)中每lg胚性愈伤组织加酶液的量为10mL。4. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于：所述步骤（3)中PEG融合诱导液的配方为：以CPW溶液为基液，每100mL中含PEG 30-50g、CaCl2 · 2H20 150mg、KH2P〇4 10mg、甘露醇3g。5. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述步骤(3)中高Ca2+_高pH溶液由甘氨酸-NaOH缓冲液和Ca (N〇3) 2溶液等量混合 而成。6. 根据权利要求5所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于：所述甘氨酸-NaOH缓冲液的配方为：甘氨酸3.75g/L、甘露醇15g/L，并使用 0 · 2mol/LNaOH 溶液调 pH 至 9-10 · 5。7. 根据权利要求5所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述Ca (N〇3) 2溶液的浓度为94.4g/L。8. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述步骤(5)中分化培养基的配方为含6-苄氨基腺嘌呤O.lmg/L、萘乙酸O.lmg/L 的MS培养基，pH 5.8。9. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述步骤(5)中生根培养基的配方为含萘乙酸1.0mg/L、吲哚丁酸OAmg/I/ 1的1/ 2MS培养基，pH 5.8。10. 根据权利要求1所述的利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，其 特征在于:所述CPW溶液的配方为:磷酸二氢钾27.2mg/L、硝酸钾101.0mg/L、二水合氯化钙 1480.0 mg/L、七水合硫酸镁246. Omg/L、碘化钾0.16mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L。
【专利摘要】本发明提供一种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下步骤：取新鲜的胚性愈伤组织加酶液酶解；原生质体分别进行IOA钝化和UV钝化，得受体原生质体和供体原生质体按1︰1混合，依次加入PEG融合诱导液、高Ca2+-高pH溶液，获得融合的杂种细胞；使用KM8P固体培养基包埋培养融合杂种细胞；将再生胚性愈伤组织颗粒依次转接至分化培养基、生根培养基上培养；当组培苗长到5-7cm栽入炼苗室中炼苗，得到体细胞杂种植株。该方法以葡萄胚性愈伤组织为材料，利用原生质体不对称融合技术成功获得获得葡萄杂种植株，为培育葡萄新品种、增强葡萄的抗性、提高葡萄品质奠定了基础。
【IPC分类】A01H4/00, A01H5/00, C12N15/05
【公开号】CN105647905
【申请号】
【发明人】吴月燕, 饶慧云, 钱萍仙, 刘蓉, 卢丹
【申请人】浙江万里学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月30日