片。
【具体实施方式】
[0036]以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示 性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语 具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0037]本实施例利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下步 骤：
[0038] 1.葡萄原生质体的分离和纯化
[0039]原生质体的分离是原生质体培养成功的一个重要环节，原生质体的酶解不仅受到 分离材料的影响，而且还与酶的种类和浓度、酶解时间、温度、pH、渗透压及其他因素有关。 如表1、表2列出不同的纤维素酶、果胶酶、离析酶、甘露醇及酶解时间对原生质体分离数量 和活力的影响。
[0040]本发明将预做原生质体分离的新鲜的胚性愈伤组织置于黑暗中培养24h，取lg愈 伤组织加10mL酶液，27±1°C、黑暗条件下60-70r · min-S振荡酶解2-12h。在原生质体酶解 过程中，从酶解后2h开始取样，之后每隔2h再取样1次放于倒置显微镜下观察原生质体酶解 情况并计数，至原生质体数比前一次所计个数不再增加时停止酶解。
[0041 ]酶解结束后，在超净工作台上把混合液依次通过200目和400目不锈钢细胞筛，去 除未酶解彻底的组织，用l_2mL的CPW溶液洗涤网，收集滤液置于15mL无菌离心管中，在 700r · mirT1下离心8min，使原生质体沉降。离心结束后弃去上层酶液及微小细胞残片，剩余 l-2mL左右的沉淀，用移液枪吸取10mL CPW溶液沿离心管壁缓慢加入悬浮管底的原生质体。 悬浮液700r · mirT1离心8min.，弃去上清液，再用CPW溶液洗涤1-2次。沉淀重悬于l-2mL原生 质体洗涤液后铺层于15mL无菌离心管内5mLCPW-23S鹿糖液层上，500r · min-1离心5min，轻 轻吸取0与CPW23S蔗糖界面的原生质体，转至15mL无菌离心管中5mL洗涤液内，在700r · min-1下离心8min，去除上清液，再用CPW溶液洗涤2-3次。最后，再加入CPW溶液，制成原生质 体悬浮液，再根据需要调节密度（1〇 5-1〇6左右)后备用。
[0042]表1各因素对葡萄原生质体分离数量的影响
[0043]
[0044] 由表1可以看出，不同的组合对原生质体酶解数量的影响不一样，以10号组合的效 果最好，原生质体的产量达12.33X 105个?ml/1。由极差分析可以得出，不同处理组合对葡 萄原生质体的酶解数量影响差异显著。各因素水平对原生质体酶解数量影响的大小顺序 为:R(果胶酶浓度)>R(纤维素酶浓度)>R(甘露醇浓度)>R(酶解时间）>R(离析酶浓度），说明 5个因素中果胶酶浓度对原生质体酶解数量影响最大，其次是纤维素酶浓度、甘露醇浓度、 酶解时间和离析酶浓度。各因素的最优水平分别是甘露醇浓度第一水平，酶解时间第二水 平，果胶酶浓度和离析酶浓度第三水平，纤维素酶浓度第四水平。
[0045]表2各影响因素对葡萄原生质体分离活力的影响
[0046]
[0047] 由表2可以看出，不同的试验组合对葡萄原生质体活力的影响不一样。以3号组合 的效果最好，原生质体的活力最高为76%。由极差分析可以得出，不同处理组合对葡萄原生 质体活力的影响差异显著。各因素水平对原生质体活力影响的大小顺序为:R(酶解时间）>R (离析酶浓度)>R(甘露醇浓度)>R(果胶酶浓度)>R(纤维素酶浓度），说明5个因素中酶解时 间对原生质体活力影响最大，其次是离析酶浓度、甘露醇浓度、果胶酶浓度，最后是纤维素 酶浓度。各因素的最优水平分别是甘露醇浓度第一水平，酶解时间第三水平，纤维素酶浓度 第一水平，果胶酶浓度第一水平和离析酶浓度第一水平。
[0048]结合以上数据和分析，最终确定本发明酶液配方如下：2.50%纤维素酶、0.25%果 胶酶、0.25 %离析酶、0.40mo 1/L甘露醇、0.1 %MES，pH 5.8。酶解时间最佳为6h。
[0049] 本发明胚性愈伤组织分离的原生质体照片如图1所示。
[0050] 2.葡萄原生质体的Ι0Α和UV钝化处理
[0051] (1)碘乙酰胺（Ι0Α)能够破坏细胞质中的细胞器，导致细胞质失活。Ι0Α溶于KM8P液 体培养基中，试验设置5个浓度梯度（1，2，4，8，16mmo 1 · L-1)，pH值均调至5 · 8，溶液经0 · 45um 微孔滤膜过滤灭菌后放于4°C冰箱备用。将醉金香葡萄原生质体分别用不同浓度的Ι0Α黑暗 4°C条件下静置钝化处理lOmin，使其细胞质失活，夏黑葡萄原生质体不做处理。或者夏黑原 生质体钝化处理而醉金香原生质体不做处理。处理后的原生质体700r · mirT1离心5min，离 心后弃上清液，用CPW溶液洗2-3遍后，加 KMsP培养基洗涤一次，最后将钝化后的原生质体用 KMsP液体培养基悬浮，原生质体密度调整为1 X 105个· ml/1备用。取1滴原生质体悬浮液于 载玻片上测定其活力，其余转入小培养皿(直径6cm)中。以KMsP为基本培养基，27 ± 1°C黑暗 条件下进行低熔点琼脂糖固体包埋培养，以不做钝化处理的为对照。每隔2d放置于倒置显 微镜下观察其形态及分裂情况。
[0052]表3不同Ι0Α浓度对醉金香原生质体的影响
[0053]
[0054]从表3可知，不同浓度的Ι0Α处理对醉金香原生质体活力的钝化作用差异显著。经 1.0,2.0,4.0,8. Ommo 1 · I/110Α处理后，醉金香原生质体活力分别比对照下降了 33.8 %， 52.2%，74.96%和76%，表明醉金香原生质体对Ι0Α十分敏感。随着Ι0Α浓度的增加，原生质 体细胞的破碎程度呈加大趋势。经4.0mmol · I^IOA处理后99%左右的醉金香原生质体都被 灭活且细胞破碎程度不是很高。说明4.Ommol · I^IOA能有效钝化醉金香葡萄的原生质体。
[0055] (2)夏黑葡萄的胚性愈伤组织经分离纯化后，将其原生质体密度调成IX 105个· ml/1，分别吸取lmL夏黑原生质体于无菌塑料小培养皿(直径3cm)中，使其刚好铺成一层并做 好记，将小培养皿放入紫外线灯箱（有2根15W紫外灯，箱底距紫外灯管25cm)中连续照射 0· 5min，lmin，2min，4min，6min，8min，16min，每个处理5皿，重复3次。照射后分别取1滴原生 质体悬浮液于载玻片上测定其活力，其余转入小培养皿（直径6cm)中。以KMsP为基本培养 基，27±1°C黑暗下进行低熔点琼脂糖固体包埋培养，以不做钝化处理为对照。每隔2d放置 于倒置显微镜下观察其形态及分裂情况。
[0056] 表4不同UV处理时间对夏黑原生质体的影响
[0057]
[0058]从表4可以看出，不同浓度的UV处理对夏黑葡萄原生质体活力的钝化作用差异显 著。经Ο · 5min，lmin，2min，4min，6min，8min，16min UV处理后，夏黑原生质体活力分别比对 照下降了 18.5%，33.9%，51.9%、59.5%、65.5%，70.8%和76%。随着群照射时间的延长， UV对夏黑原生质体活力的钝化作用增强，且细胞破碎程度加深。其中8min UV照射处理原生 质体的细胞破碎程度开始增大，如再延长处理时间会增强原生质体的钝化，出现更多的原 生质体细胞死亡、破碎。因此，UV照射8min能有效钝化夏黑葡萄的原生质体。
[0059]将Ι0Α(醉金香)和UV(夏黑）钝化处理后的原生质体按体积比1:1在离心管中混合 备用。
[0060] 3.葡萄原生质体的融合
[0061]本发明采用PEG-高pH-高Ca2+法诱导葡萄原生质体的融合，影响PEG融合的因素主 要有PEG的种类、分子量、处理时间、浓度、原生质体的密度以及生理状态等。PEG融合法所需 设备简单，操作简单，处理量大，没有明显的融合特异性。PEG融合法的不足之处在于处理时 间较长，操作过程比较复杂，对原生质体融合时所需的密度较大，而且对原生质体的伤害也 较大。因此，试验过程中要严格控制各因素对原生质体融合的影响。
[0062] 本发明将PEG的浓度设置为20 %，30 %，40 %，50%。用小试管进行融合处理时，取 混合好的两亲本原生质体悬浮液0.5-lmL，吸取l-2mL的PEG融合诱导液沿小试管壁缓慢加 入，同时转动小试管，使PEG溶液与原生质体充分接触，促使原生质体相互粘连。此过程在 25-30°C下约需15-30min，镜检可以看到两亲本原生质体聚集粘连。保温后，用同样的方法 加入约2mL的高Ca 2+-高pH溶液，混合后保温约10-15min。
[0063] 表5PEG浓度对细胞融合的影响
[0064]
[0065]从表5可知，随着PEG浓度的增加，异源融合率呈先上升后下降的变化，其中PEG浓 度为40%时，融合率最大，为7.8%，但高于40%以后，融合率下降。但当PEG浓度为50 %时， 融合产物不能存活，大量的原生质体破碎，逐渐死亡。由于PEG本身对原生质体具有一定的 毒性，为减少其对融合产物生长发育的副作用，选择40%的PEG浓度作为醉金香和夏黑原生 质体融合的适宜浓度，此时多数原生质体呈一对一融合，异源融合率为7.8%。
[0066]根据以上试验，最终确定本发明PEG融合诱导液的配方为：以CPW溶液为基液，每 100mL中含PEG 30-50g、CaCl2 · 2H20 150mg、KH2P〇4lOmg、甘露醇3g。
[0067] 高Ca2+_高pH溶液由甘氨酸-