利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于葡萄体细胞杂交技术领域，具体涉及一种利用原生质体不对称融合技 术获得葡萄杂种植株的方法。
【背景技术】
[0002] 植物有性杂交仅限于部分亲缘关系较近的栽培种与野生种之间或种内，有些植物 的有性生殖能力很低甚至不具备，所以很难通过有性杂交的方式来改良与培育新品种，严 重限制了育种工作的进展。我国南方葡萄常规育种的方法包括杂交育种、引种、实生选种、 诱变育种以及芽变选种等。而植物体细胞杂交技术则可以通过异源原生质体的融合，广泛 地重组植物界优良的遗传性状，克服远缘有性杂交不亲和性，缩短育种年限，扩大基因重组 范围，为创造新型植物开辟了广泛的应用前景，也为植物育种和创造育种材料开创了一条 全新的途径，因而已开始应用于农作物、蔬菜、果树、中药材以及其他植物的品种改良，并且 获得了种间、种内、属间的杂种体细胞或胞质杂种。利用细胞融合技术育种是进行葡萄种质 资源创新的一条有效途径，可以缩短葡萄的育种年限，提高育种效率，创造新的品种和类 型。有关葡萄原生质体融合方面的研究报道还很少，筛选适宜的基因型是葡萄原生质体能 否培养成功的重要因素，在葡萄原生质体培养研究中进行了大量的基因型筛选，而最后仅 有少量的基因型材料获得再生植株，还处于摸索阶段。对葡萄原生质体培养的最适条件，原 生质体钝化的最佳剂量，原生质体融合的最佳PEG浓度、融合后杂种体细胞的培养以及植株 再生的相关适宜条件等都研究的不多，还没有形成成熟的技术体系。
[0003] 授权公告号为CN101139582A的中国发明专利公开了一种利用原生质体不对称融 合技术获得香蕉体细胞杂种的方法。该方法是将香蕉胚性悬浮细胞在酶解液中进行酶解获 得原生质体，受体原生质体用碘乙酰胺进行处理，供体原生质体用紫外灯进行照射处理，将 供体原生质体和受体原生质体混合后，用聚乙二醇法进行融合。融合产物悬浮于原生质体 液体培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体细胞胚诱导培养基上进行培养，直至 体细胞胚萌发，再进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。授权公告号为CN102505004A的 中国发明专利公开了一种草莓原生质体的提取及融合的方法。该方法是以草莓的叶片为研 究材料，通过前处理和酶解相结合的方式获得高活力的原生质体，利用30-45%PEG 6000结 合高Ca2+，高pH的方法诱导两者融合，提高了原生质体一对一融合的概率，分离的原生质体 活力在85%以上，一对一融合率最高可达到11.7%。授权公告号为0附04429939六的中国发 明专利公开了一种利用二倍体细胞与花粉细胞融合育种法培育三倍体霍山石斛的方法。
[0004] 葡萄较其他果树在原生质体培养以及植株再生技术方面的研究进展缓慢，而且是 被公认的难于进行植株再生和遗传转化的果树品种之一。有关葡萄原生质体分离纯化、培 养以及融合方面存在极少成功范例。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种利用原生 质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法。该方法以葡萄胚性愈伤组织为材料，对原 生质体的分离纯化、原生质体的培养、原生质体的融合、杂种细胞的选择、杂种细胞的培养 等进行研究。本发明初步建立起了葡萄原生质体的培养和融合技术体系，为培育葡萄新品 种、增强葡萄的抗性、提高葡萄品质奠定了基础，具有十分重要的理论和实际应用价值。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种利用原生质体不对称融合技术获得葡萄杂种植株的方法，包括以下操作步 骤：
[0008] (1)原生质体的分离和纯化:取新鲜的胚性愈伤组织加酶液，在26-28Γ、黑暗条件 下，60-70r/min振荡酶解2-12h，然后分离纯化得到葡萄原生质体；
[0009] (2)原生质体的的钝化处理：
[0010] (a) Ι0Α钝化:取步骤（1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度 为0.5-1 X 105个/mL的悬浮液，然后加入1:5配比（体积比）的4.0-8. Ommol/L碘乙酰胺（Ι0Α) 溶液钝化处理9-1 lmin，处理完后使用CPW溶液洗涤2-3遍，用KMsP液体培养基悬浮，将原生 质体密度调整为0.5-1 X105个/mL，得到受体原生质体；
[0011] (b)UV钝化:取步骤（1)获得的原生质体使用CPW溶液悬浮，调整到原生质体密度为 0.5-1 X 105个/mL的悬浮液，在1250-1350yW/cm2紫外光照强度下照射0.5-16min，得到供体 原生质体；
[0012] (3)原生质体的融合:将步骤(3)(a)得到的受体原生质体和步骤(3)(b)得到的供 体原生质体按1:1体积比混合，得亲本悬浮液，加入1-4倍亲本悬浮液体积的PEG融合诱导 液，在25-30 °C下保温15-30min，再加入2-4倍亲本悬浮液体积的高Ca2+-高pH溶液，混合后在 25-30°C下保温10_15min，然后使用CPW溶液洗涤2-3遍，离心得到融合的杂种细胞；
[0013] (4)融合体细胞的培养:使用KMsP固体培养基包埋培养步骤(3)得到的融合杂种细 胞，在25-27 °C、黑暗条件下静置培养，直至长出再生胚性愈伤组织颗粒；
[0014] (5)再生胚性愈伤组织胚状体的诱导：将再生胚性愈伤组织颗粒转接至分化培养 基上诱导胚状体，直至长出不定芽，再将不定芽转接到生根培养基上培养；
[0015] (6)炼苗与移栽：当组培苗长到5-7cm、且根系生长旺盛时，将组培苗移栽入炼苗室 中进行炼苗，即得到体细胞杂种植株。
[0016] 所述步骤⑴中酶液的配方为：2.50 % (g/100mL，下同）纤维素酶、0.25 %果胶酶、 0.75 %离析酶、0.40mo 1/L甘露醇、0.1 %MES(2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸），pH 5.8。
[0017 ]所述步骤(1)中每1 g胚性愈伤组织加酶液的量为1 〇mL。
[0018] 所述步骤(3)中PEG融合诱导液的配方为：以CPW溶液为基液，每100mL 中含PEG30-50g、CaCl2 · 2H20 150mg、KH2P〇4lOmg、甘露醇3g。
[0019] 所述步骤(3)中高Ca2+_高pH溶液由甘氨酸-NaOH缓冲液和Ca (N〇3) 2溶液等量混合 而成。其中所述甘氨酸-NaOH缓冲液的配方为：甘氨酸3.75g/L、甘露醇15g/L，并使用 0 · 2mol/LNa0H 溶液调 pH 至 9-10.5;所述 Ca(N03)2 溶液的浓度为 94 · 4g/L。
[0020] 所述步骤（5)中分化培养基的配方为含6-苄氨基腺嘌呤0.1mg/L、萘乙酸(NAA) 0.1mg/L的MS培养基，pH 5.8。
[0021] 所述步骤（5)中生根培养基的配方为含萘乙酸（NAA)1.0mg/L、吲哚丁酸（IBA) 0.5mg/L-1 的1/2MS培养基，pH 5.8。
[0022] 所述CPW溶液的配方为：磷酸二氢钾(KH2P〇4)27.2mg/L、硝酸钾(KN0 3)101.0mg/L、 二水合氯化钙（CaCl2 · 2H20) 1480.Omg/L、七水合硫酸镁(MgS〇4 · 7H20)246.0mg/L、碘化钾 (1(1)0.1611^/1、五水合硫酸铜（(：113〇4,5!1 20)0.0251^/1。
[0023] 原生质体从分离纯化、培养、胚状体诱导以及到再生植株的过程极其漫长复杂，这 一过程中的各个步骤对原生质体的培养及植株再生都有着决定性的作用。合适的基因型、 原生质体的分离材料、渗透压稳定剂的浓度、酶解时间、离心转速和时间、培养温度以及pH 值等都对植株再生有一定的影响，以上这些影响因素在原生质体的培养过程中影响也较 大。
[0024]与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
[0025] (1)以葡萄胚性愈伤组织分离的原生质体为材料，比叶片、茎段、普通愈伤组织等 分离的材料分化能力更强，更易获得再生植株，且取材方便，不受时间、季节等气候条件的 限制，可根据需要随时进行葡萄胚性愈伤组织的诱导培养；
[0026] (2)采用的原生质体培养基为KMsP培养基，比MS、B5、D2以及CPW-13M等培养基的Ca 2+ 浓度高，NH4+浓度低，碳源丰富，原生质体生长所需的各种营养物质丰富，如维生素、水解酪 蛋白、微量元素等，因此，取得了较好的培养效果；
[0027] (3)受体和供体原生质体在融合前分别进行钝化处理，可达到只有融合产物才能 够再生植株，因此所获得的再生植株绝大多数为杂种，可减少培养过程的工作量及后期对 杂种的筛选和鉴定工作；
[0028] (4)原生质体融合采用的是不对称的融合方式，所获得的杂种植株为不对称杂种；
[0029] (5)本发明步骤简单，耗时短，对设备和培养条件的要求较低，有效地解决了葡萄 原生质体培养及融合困难的问题，为建立起葡萄原生质体分离纯化、培养以及融合的成熟 技术体系提供了一定的理论依据和技术支持。
【附图说明】
[0030] 图1所示的是本发明胚性愈伤组织分离的原生质体照片；
[0031] 图2所示的是本发明葡萄原生质体融合的照片；
[0032] 图3所示的是本发明葡萄原生质体培养的照片；
[0033] 图4所示的是本发明葡萄胚性愈伤组织体细胞胚的照片；
[0034] 图5所示的是本发明葡萄原生质体经融合获得的杂种植株照片；
[0035] 图6所示的是本发明葡萄杂种植株生根炼苗的照