包括以下步骤：
[0084] 种子制备：
[0085]将菌株TP-02在PDA斜面培养基中培养3d后用无菌水洗下孢子，使用血球计数板计 算孢子数并稀释至1 X 1〇5个/mL。按10 %接种量接入装液量200mL (500mL三角瓶)液态种子 培养基中，于30°C、200rpm条件下培养24h后作为种子液备用，并将所得种子液保存在-80 °(：超低温甘油冻结管中；
[0086]取-80 °C超低温甘油冻结管置室温溶解并划线roA斜面培养基，于30 °C培养培养3d 后用无菌水洗下菌丝或孢子，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌 丝悬液接入48mL液态种子培养基中，接种后种子培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养 基，于30°C，摇床转速为200rpm，恒温培养24h后，即为摇瓶发酵产酶的种子培养液。
[0087]液态发酵生产纤维素酶：
[0088]在3L发酵罐中装2L液态发酵培养基，接入200mL种子培养液进行发酵。发酵条件： 培养温度为30°C，搅拌转速为450r/min，通气量为4.5vvm，罐压为0.03MPa，通过流加氨水控 制pH在5.0~5.5范围内，具体?!1可以为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5这些数值。在上述培养条 件下，培养88h，期间每4h从发酵液中吸取lmL液体并对其酶活力进行测定。发现培养84h后， 滤纸酶活力达到16.98IU/mL，内切酶酶活达到41.33IU/mL，外切酶酶活达到3.65IU/M1，葡 聚糖苷酶酶活力达到15.98IU/mL，如图3所示。
[0089]所述液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有：80~120目的玉米秸杆8g，5%麸 皮浸出汁90g，（NH4)2S〇4 20g，KH2P〇4 5g，MgS〇4.7H20 7g，CaCl2 15g，Tween80 0.15g，微量 元素：FeS〇4 · 7H20 0.003g，MnS〇4 · H20 0.001g，ZnS〇4 · 7H20 0.001g，CoCl2 · 6H20 O.OOlg， pH 5.0〇
[0090] 实施例7
[0091] 纤维素酶的检测方法
[0092] 滤纸酶活的测定:准确吸取适当稀释10-50倍的酶液0.5mL，放入一条lcm X 6cm的 滤纸于pH 4.8的0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液及0.5mL pH 4.8的0.05mol/L柠檬 酸一柠檬酸钠缓冲溶液，于50°C保温30min后加入3mL DNS试剂沸水浴lOmin，冷却后加水稀 释至25mL，测定520nm处吸光值。
[0093] β-葡萄糖苷酶:准确吸取适当稀释10-50倍的酶液0.5mL，加入lmL质量分数为1 % 水杨苷(溶于pH 4.8的0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液)及0.5mL pH 4.8的0.05mol/ L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液，于50°C保温30min后加入3mL DNS试剂沸水浴lOmin，冷却后 加水稀释至25mL，测定520nm处吸光值。
[0094]内切酶酶活测定：准确吸取适当稀释10-50倍的酶液0.5mL，加入lmL质量分数为 1%CMC(溶于pH 4.8的0.05mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液)及0.5mL pH 4.8的0.05mol/ L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液，于50°C保温30min后加入3mL DNS试剂沸水浴lOmin，冷却后 加水稀释至25mL，测定520nm处吸光值。
[0095] 外切酶酶活测定:确吸取适当稀释10-50倍的酶液0.5mL，加入lmL质量分数为2% 微晶纤维素酶(溶于口114.8的0.05111〇1/1柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液)及0.51^?!14.8的 0.05mo 1 /L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液，于50 °C保温30miη后加入3mL DNS试剂沸水浴 lOmin，冷却后加水稀释至25mL，测定520 nm处吸光值。
[0096] 纤维素酶活力单位定义:在上述反应条件下，每分钟水解生成Ιμπιο?葡萄糖所需的 酶量为1个酶活国际单位(IU)。
[0097] 上述参照实施例对产纤维素酶菌株的筛选方法及其发酵生产纤维素酶的方法进 行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此 在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种产纤维素酶菌株的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤:初筛、 原生质体制备、紫外光照诱变选育、复筛； 所述产纤维素酶菌株现在由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC) 保藏，保藏编号为No . 11119，分类命名为葡枝根霉点头变种Rhizopus stolonifer var.refiexus〇2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法具体包括以下步骤： A. 初筛培养基初筛，所述初筛培养基的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖 3_5g;琼脂 10_20g ;MandelS 无机营养盐 lOOOmL; B. 制备原生质体，将初筛得到的菌株的孢子于PDA培养基中培养，经纯化、离心后获得 的菌丝于破壁液中振荡孵育，过滤、离心纯化后得到原生质体;所述破壁液的成分为蜗牛 酶:纤维素酶= 3:1; C. 诱变选育，将步骤B得到的原生质体用15W紫外灯照射进行诱变处理，处理液涂布于 高渗初筛培养基平板上，培养后菌落转接到PDA斜面培养基培养； 所述高渗初筛培养基平板的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖3-5g;琼脂 10_20g;MandeIS无机营养盐lOOOmL;KC1 0.6mol; D. 复筛;将步骤C得到的PDA斜面培养基上的培养物的孢子悬液接种于液态种子培养基 中培养，并将种子培养液按1:10体积比接种到液态发酵培养基中培养，过对发酵产物酶解 还原糖产量的测定，筛选出酶活性高的菌株，即为产纤维素酶菌株TP-02。3. 根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述液态种子培养基的成分为：10% 麸皮浸出汁。4. 根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述液态发酵培养基的成分为:每L培 养基含有：80~120目的玉米秸杆、稻草或麦杆5-10g，5%麸皮浸出汁80-100g，（NH4) 2S04 2〇-30g，KH2P〇4 5-10g，MgS〇4.7H20 5-10g，CaCl2 10_20g，Tween80 0.15-0.25g，微量元素： FeS04· 7H20 0.003-0.005g,MnS04· H2O 0.001-0.00156g,ZnS04· 7H20 0.001-0.0014g, CoCh · 6H2O 0.001_0.002g，pH 5.0。5. 根据权利要求1所述的筛选方法筛选得到的菌株作为生产维素酶的应用。6. -种维素酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 使用液态种子培养基对根据权利要求1所述的筛选方法筛选得到的菌株TP-02进行 种子培养，得到种子培养液； (2) 将种子培养液接种到液态发酵培养基中培养，液态发酵产纤维素酶。7. 根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述步骤（1)具体包括以下步骤:对根 据权利要求1所述的筛选方法筛选得到的菌株TP-02先后经TOA斜面培养基、液态种子培养 基进行培养，并将所得种子液保存在_80°C超低温甘油冻结管中； 将在-80°C超低温甘油冻结管中保存的种子液先后经TOA斜面培养基、液态种子培养基 培养后即可制得种子培养液。8. 根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(2)中，种子培养液与液态发 酵培养基的体积之比为1:9~10。9. 根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于，所述步骤（2)中的培养条件是30°C、 200~350r/min培养84~96小时。10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(2)中的培养条件还包括： 发酵罐中通气量为4.5vvm，罐压为0.03MPa，pH为5.0~5.5范围。
【专利摘要】本发明公开了一种产纤维素酶菌株的筛选方法及其发酵生产纤维素酶的方法，所述菌株是从黄山生态林腐木中通过初筛、原生质体制备、紫外光照诱变选育、复筛得到的一种名称为TP-02的产纤维素酶的菌株，该菌株具备高产纤维素酶的能力，可以豆粕、硫酸铵、尿素或氯化铵为氮源，以麸皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草秸秆或玉米秸秆为碳源经液态发酵，在培养72～84小时后，其滤纸酶活力可达到16.98IU/mL，内切酶酶活达到41.33IU/mL，外切酶酶活达到3.65IU/mL，β-葡聚糖苷酶酶活力达到15.98IU/mL。CGMCC No.1111920150716
【IPC分类】C12N13/00, C12N15/01, C12N9/42, C12R1/845
【公开号】CN105647904
【申请号】
【发明人】汤斌, 张庆庆, 汤文晶, 李松
【申请人】安徽工程大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月31日