(LD比值）的大小选择高活力菌株。选取LD比值大的菌落移接到 PDA试管斜面上培养保存备用(见图1)。
[0043] 原生质体制备：
[0044]将PDA试管斜面保藏的匍枝根霉菌株的孢子用生理盐水洗脱，混匀后稀释至IX 105个/mL;将上述孢子悬液转接于含有100mL PDA培养基的500mL三角烧瓶中，调整孢子浓 度为1〇7个/mL，于转速为150r/min的摇床上培养12h;将所得培养物于3500r/min离心，取沉 淀，并用生理盐水洗涤两次、离心，再用〇.6mol/L KC1高渗溶液洗涤一次离心取沉淀；
[0045] 利用电子天平准确称取2g经处理后的菌丝体，加入20mL 3mg/mL破壁液，破壁液的 成分为蜗牛酶:纤维素酶=3:1，充分混匀，于30°C，160rpm震荡孵育，并每隔0.5h镜检一次 观察原生质体的生成情况计数，确定酶解时间，用四层无菌显微镜纸将原生质体液过滤，去 除菌丝片段取滤液，3500r/min离心10min，收集原生质体，用有机糖醇渗透压稳定剂洗2次， 得到纯化的原生质体。
[0046] 诱变选育：
[0047] 取5mL上述纯化的原生质体于无菌的9cm培养皿中，用15W紫外灯距离30cm处照射 进行诱变，紫外灯事先预热30min以使得紫外光照稳定，取不同照射时间的处理液，涂布于 高渗初筛培养基平板上，高渗初筛培养基平板的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5-10g;葡 萄糖3-5g;琼脂10-20g;MandelS无机营养盐1000mL;KCl 0.6mol;黑暗避光30°C恒温培养， 待平板长出菌落后，转接PDA斜面培养；
[0048] 利用CMC-刚果红平板法，初步筛选出透明圈与菌落直径较大的菌株，通过摇瓶发 酵复筛的方法选出高活性纤维素酶的突变株。
[0049] 复筛：
[0050] 将PDA斜面培养物用生理盐水洗下，充分混匀适当稀释至IX 105个/mL，制备成孢 子悬液;将孢子悬液接种于内含50mL液态种子培养基的250mL三角瓶中，液态种子培养基的 成分为10%麸皮浸出汁(称取l〇〇g麸皮，加入800mL蒸馏水煮沸30min，4层纱布过滤，定容至 1000mL)，调整孢子浓度为10 7个/mL，于转速为150r/min的摇床上培养12h，得到种子培养 液；
[0051 ] 于500mL三角瓶内添加约200mL的液态发酵培养基，接入20mL种子培养液，30°C， 180rpm振荡培养12h。所述液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有:80~120目的玉米猜 杆、稻草或麦杆5-10g，5%麸皮浸出汁8〇-100g，（NH4)2S〇4 2〇-30g，KH2P〇4 5-10g，MgS〇4 · 7H20 5-10g，CaCl2 10_20g，Tween80 0.15-0.25g，微量元素：FeS〇4*7H20 0.003-0.005g， MnS04*H20 0.001-0.00156g,ZnS04 · 7H20 0.001-0.0014g,C0CI2 · 6H20 0.001-0.002g,pH 5.0〇
[0052]通过对发酵产物酶解还原糖产量的测定，筛选出酶活性高的菌株进入下一轮发酵 产酶条件的研究。
[0053]表1水解圈大小与酶活力高低的关系
[0054]
[0055]
[0056]对筛选出来的菌株TP-02进行连续传代10代，通过液体发酵的方式，测定其酶活， 研究其遗传稳定性如表1所示，由表1可知，突变株TP-02经传 10代培养，任意2代间FPA和CMC 酶活力，差值均在10%内，表明该菌株产酶性能稳定，可作为后继实验出发菌株。
[0057] 表2突变株TP-02遗传稳定性 rnnwi
[0059] 菌种鉴定：
[0060] 经PCR获得该菌种的ITS-5.8S rDNA序列并经测序与NCBI上利用核苷酸比对。从 NCBI上获得相关菌种的公认标准序列数据，用ClustalX 1.8进行多重分析比对。利用 MEGA3.1、PAUP软件，以根霉属的近缘属种里氏木霉为外群，构建MP和ML系统发育树。本研究 菌种与匍枝根霉点头根霉序列同源率高达99.8%。一般认为同源率大于98%可以认为属于 同一个种。因此根据分子学水平鉴定为根霉属匍枝根霉亚种点头根霉。结合形态学鉴定结 果，初步鉴定TP-02菌株为接合菌亚门、藻状菌纲、毛霉目、毛霉科、根霉属菌、匍枝根霉亚种 点头根霉，其基因序列表如SEQUENCE LISTING 1所示。
[0061 ] 实施例2
[0062] -种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
[0063] 其它同实施例1，只是其中的初筛培养基的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5g;葡 萄糖3g;琼脂10g; Mande 1S无机营养盐1 OOOmL;
[0064] 高渗初筛培养基平板的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5g;葡萄糖3g;琼脂10g; Mande IS 无机营养盐 1 OOOmL ;KC1 0.6mol;
[0065]液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有：80~120目的玉米猜杆5g，5%麸皮浸 出汁80g，（NH4)2S〇4 20g，KH2P〇4 5g，MgS〇4.7H20 5g，CaCl2 10g，Tween80 0.15g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.003g，MnS〇4· H20 0.001g，ZnS〇4· 7H20 0.001g，CoCl2· 6H20 0.001g，pH 5.0〇
[0066] 实施例3
[0067] -种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
[0068]其它同实施例1，只是其中的初筛培养基的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 10g; 葡萄糖5g;琼脂20g;MandelS无机营养盐lOOOrnL;
[0069]高渗初筛培养基平板的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 10g;葡萄糖5g;琼脂20g; Mande IS无机营养盐 1000mL;KCl 0.6mo 1 ；
[0070]液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有:80~120目的稻草10g，5%麸皮浸出汁 100g，（NH4)2S〇4 30g，KH2P〇4 10g，MgS〇4.7H20 10g，CaCl2 20g，Tween80 0.25g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.005g，MnS〇4· H20 0.00156g，ZnS〇4· 7H20 0.0014g，CoCl2· 6H20 0.002g，pH 5.0〇
[0071] 实施例4
[0072] -种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
[0073] 其它同实施例1，只是其中的初筛培养基的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 8g;葡 萄糖4g;琼脂15g; Mande 1S无机营养盐1 OOOmL;
[0074] 高渗初筛培养基平板的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 8g;葡萄糖4g;琼脂15g; Mande IS 无机营养盐 1 OOOmL ;KC1 0.6mol;
[0075]液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有：80~120目的麦杆8g，5%麸皮浸出汁 90g，（NH4)2S〇4 25g，KH2P〇4 8g，MgS〇4.7H20 8g，CaCl2 15g，Tween80 0.2g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.004g，MnS〇4· H20 0.0014g，ZnS〇4· 7H20 0.0012g，CoCl2 · 6H20 0.0015g，pH 5.0〇
[0076] 实施例5
[0077] -种维素酶的生产方法，所述方法包括以下步骤：
[0078]种子的制备方法同实施例2;
[0079]液态发酵生产纤维素酶：
[0080]吸取5mL种子培养液接入45mL液态发酵培养基，接种后发酵培养基装基装液量为 250mL三角瓶装50mL培养基。接种后置于震荡恒温培养中培养，培养温度为30°C，摇床转速 为200rpm/min，总培养时间为4d，期间每12h从发酵液中吸取lmL液体并对其酶活力进行测 定。在发酵培养84h之后，发酵液中纤维素酶滤纸酶活(FPA)、内切酶酶活、外切酶酶活和β-葡聚糖苷酶酶达到最大值，分别为13.16IU/mL，45.81IU/mL、0.537IU/mL，12.45IU/mL，如图 2所示。
[0081]所述液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有:80~120目的麦杆5g，5%麸皮浸 出汁 100g，（NH4)2S〇4 26g，KH2P〇4 8g，MgS〇4.7H20 9g，CaCl2 18g，Tween80 0.2g，微量元素： FeS〇4· 7H20 0.004g，MnS〇4· H20 0.0015g，ZnS〇4· 7H20 0.0013g，CoCl2 · 6H20 0.0015g，pH 5.0〇
[0082] 实施例6
[0083] 一种维素酶的生产方法，所述方法