一种产纤维素酶菌株的筛选方法及其发酵生产纤维素酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种产纤维素酶菌株的筛选方法及其发酵生 产纤维素酶的方法。
【背景技术】
[0002] 木质纤维类物质是地球上分布最广、储藏最丰富的物质，也是最廉价的可再生资 源。纤维素酶则是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，将 纤维素降解产生寡糖和纤维二塘，最终水解为葡萄糖、木糖等单糖，进而可进一步制取酒 精、食品、单细胞蛋白、医药品及其他化学化工原料。因此，纤维素酶在燃料乙醇制取、造纸、 饲料加工等行业具有良好的应用前景。
[0003]纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌 种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后 期的分离提取。纤维素酶是由三种不同的酶组成的多酶复合物:外切葡聚糖酶、内切葡聚糖 酶和葡萄糖苷酶(BGL)，三种酶协同作用完成对纤维素的水解。
[0004]目前纤维素酶的应用依然在一定程度上受限于居高不下的生产成本问题。纤维素 酶高生产成本问题主要表现为以下两个方面:其一，纤维素酶的产生菌株的发酵酶活力相 对较低，一直是大规模生产急需解决的问题，也是长期制约纤维素酶大量生产并限制其应 用的主要因素;其二，目前使用的丝状真菌由于菌种特性和培养条件等因素使得纤维素酶 发酵时间普遍较长，成本过高。目前关于纤维素酶生产和研究的丝状真菌主要有木霉属、曲 霉属和青霉属微生物，发酵周期一般在6d以上，具有耗时长、效率低等特点。
【发明内容】
[0005] 针对以上不足，本发明提供了一种产纤维素酶的菌株的筛选方法，所述菌株是从 黄山生态林腐木中通过初筛、原生质体制备、紫外光照诱变选育、复筛得到的一种名称为 TP-02的产纤维素酶的菌株。
[0006] 本发明还提供了通过上述筛选方法筛选得到的菌株作为生产维素酶的应用。此菌 株具备高产纤维素酶的能力，可以豆柏、硫酸铵、尿素或氯化铵为氮源，以麸皮汁、乳糖、淀 粉糖、稻草秸杆或玉米秸杆为碳源经液态发酵，在培养72~84小时后，其滤纸酶活力可达到 16.98IU/mL，内切酶酶活达到41.33IU/mL，外切酶酶活达到3.65IU/mL，i3-葡聚糖苷酶酶活 力达到 15.98IU/mL。
[0007] 本发明还提供了一种维素酶的生产方法，该方法相对于其他现有技术，其发酵产 酶周期大大缩短。
[0008] 本发明采取的技术方案为：
[0009] -种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤:初筛、原生质体制 备、紫外光照诱变选育、复筛；
[0010] 所述产纤维素酶菌株已于2015年7月16日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所；保藏编号为CGMCC心.11119;分类命名为葡枝根霉点头变种仙^〇?1^ stolonifer var.reflexus〇
[0011] 所述筛选方法具体包括以下步骤：
[0012] A.初筛培养基初筛，所述初筛培养基的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5-10g;葡 萄糖 3-5g;琼脂 10_2(^;1&111(1615无机营养盐100〇1111^
[0013] B.制备原生质体，将初筛得到的菌株的孢子于PDA培养基中培养，经纯化、离心后 获得的菌丝于破壁液中振荡孵育，过滤、离心纯化后得到原生质体;所述破壁液的成分为蜗 牛酶:纤维素酶= 3:1;
[0014] C.诱变选育，将步骤B得到的原生质体用15W紫外灯照射进行诱变处理，处理液涂 布于高渗初筛培养基平板上，培养后菌落转接到PDA斜面培养基培养；
[0015] 所述高渗初筛培养基平板的成分为:每L培养基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖3-5g; 琼脂10-20g; Mandel S无机营养盐1000mL; KC1 0.6mo 1;使用高渗初筛培养基平板可以维持 合适的生理渗透压，避免原生质体破碎。
[0016] D.复筛;将步骤C得到的TOA斜面培养基上的培养物的孢子悬液接种于液态种子培 养基中培养，并将种子培养液按1:10体积比接种到液态发酵培养基中培养，过对发酵产物 酶解还原糖产量的测定，筛选出酶活性高的菌株，即为产纤维素酶菌株TP-02。
[0017] 所述液态种子培养基的成分为：10%麸皮浸出汁，其制备方法为称取100g麸皮，加 入800mL蒸馏水煮沸30min，4层纱布过滤，定容至1000mL。
[0018]所述液态发酵培养基的成分为:每L培养基含有:80~120目的玉米猜杆、稻草或麦 杆5-10g，5%麸皮浸出汁80_100g，（NH4)2S〇4 2〇-30g，KH2P〇4 5-10g，MgS〇4.7H20 5-10g， CaCl2 10_20g，Tween80 0.15-0.25g，微量元素：FeS〇4.7H20 0.003-0.005g，MnS04.H20 0.001-0.00156g,ZnS04· 7H20 0.001-0.0014g,C0CI2 · 6H20 0.001-0.002g,pH 5.0〇
[0019] 本发明还提供了根据上述筛选方法筛选得到的菌株作为生产维素酶的应用。
[0020] 本发明还提供了一种维素酶的生产方法，所述方法包括以下步骤：
[0021] (1)使用液态种子培养基对根据权利要求1所述的筛选方法筛选得到的菌株TP-02 进行种子培养，得
[0022]到种子培养液；
[0023] (2)将种子培养液接种到液态发酵培养基中培养，液态发酵产纤维素酶。
[0024] 所述步骤(1)具体包括以下步骤:对根据权利要求1所述的筛选方法筛选得到的菌 株TP-02先后经PDA斜面培养基、液态种子培养基进行培养，并将所得种子液保存在-80°C超 低温甘油冻结管中；将在-80°C超低温甘油冻结管中保存的种子液先后经PDA斜面培养基、 液态种子培养基培养后即可制得种子培养液。
[0025] 所述步骤(2)中，种子培养液与液态发酵培养基的体积之比为1:9~10。
[0026] 所述步骤(2)中的培养条件是30°C、200~350r/min培养84~96小时。
[0027]进一步地，所述步骤（2)中的培养条件还包括：搅拌转速为450r/min，通气量为 4.5vvm，罐压为0.03MPa，pH为5 · 0~5 · 5范围，此过程中通过流加氨水控制pH在5 ·0~5 · 5范 围内。
[0028] 相对于现有技术，本发明具有以下优点：
[0029] 1.菌种生长速度快，产酶速率高，发酵时间短，在4d内可结束发酵；
[0030] 2.菌种为野生菌，活力旺盛，不易染菌，易于纯培养；
[0031] 3.菌种可利用农业副产物如麸皮汁、稻草秸杆(或麦秸杆、玉米秸杆)发酵产纤维 素酶，营养基质利用范围广且成分廉价、易得；
[0032] 4.重复摇瓶发酵性能稳定，其滤纸酶活力达到13. 16IU/mL，内切酶酶活达到 45 · 81 IU/mL，外切酶酶活达到0 · 537IU/mL，葡聚糖苷酶酶活力达到12 · 45IU/mL;
[0033] 5.在发酵罐中培养72小时后，其其滤纸酶活力可达到16.98IU/mL，内切酶酶活达 到41 · 33IU/mL，外切酶酶活达到3 · 65IU/mL，葡聚糖苷酶酶活力达到15 · 98IU/mL;
[0034] 6.发酵pH适应范围广，工艺控制简单。
【附图说明】
[0035] 图1为初筛菌落在培养基上的水解圈；
[0036] 图2为实施例5中TP-02菌株产酶特性研究；
[0037] 图3为实施例6中TP-02菌株产酶特性研究。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1
[0039] -种产纤维素酶菌株的筛选方法，所述筛选方法包括以下步骤：
[0040] 初筛：
[00411取1 g含有目的菌种的材料(黄山生态林腐木)粉碎;加入1 OmL生理盐水，振荡lh。将 上述悬浮液全部加入200mL PDA培养基中，30°C，180rpm振荡培养12h;
[0042] 将上述培养物利用生理盐水依次稀释10倍至10'10'10-5,并分别涂布于PDA平 板培养基上，30°C静置培养至有菌落出现，选取典型单菌落转接PDA斜面，并同时制片做纯 度检查，获得纯培养体;将纯培养体点种至初筛培养基，所述初筛培养基的成分为:每L培养 基含有:CMC-Na 5-10g;葡萄糖3-5g;琼脂 10-20g;MandelS无机营养盐 1000mL，28°C培养48h 后用lmg/mL的刚果红染液染色2h，倾去染液后再用lmol/L的NaOH溶液洗涤过多染液，抑制 酶活性，固定水解圈大小。菌体若能分泌纤维素酶，则在菌落周围会出现清晰的水解圈，依 据水解圈与菌落直径比值