20ml 10 %的甘油重悬菌体；
[0053] (4)在4°C条件下，4000rpm离心10min，弃上清，加入10ml含有10%甘油重悬菌体； [0054] (5)在4°C条件下，4000rpm离心10min，弃上清，缓慢加入2ml含有10%甘油重悬菌 体；
[0055] (6)将制好的感受态分装(每管50μ1)，液氮冷冻后于_80°C保存备用。
[0056] C:电击转化农杆菌
[0057] (1)在冰上将ΙμL的重组质粒pCB302-3-PlCYP82加入50μ1电击农杆菌感受态中，轻 轻混和均匀；
[0058] (2)将混合物加入电极杯的中央后再把电极杯放入槽孔中；
[0059] (3)调农杆菌电击参数，电击混合物；
[0060] (4)加入lOOylLB液体培养基后将混合物吸出，再加入500ylLB液体培养基，28°C， 230rpm 复苏 2h;
[0061 ] (5)将上述混合物均匀涂在含100mg/L Kan和100mg/L Carb的LB平板上；
[0062] (6)在28 °C黑暗温箱中倒置培养2-3d;
[0063] (7)挑取单克隆菌株进行PCR检测。
[0064] D:浸花法拟南芥转化
[0065] lml:20ml接种农杆菌。28°C，250rpm过夜培养，次日按5ml: 100ml接种，28°C， 250rpm过夜培养，次日上午测0D值，用LB+Kan+Carb作为空白对照，当菌液达到0D600为0.8 左右时，4°C，5000g离心 12min收集菌体。100ml悬浮液（1/2MS，10mM MgCl2，5%蔗糖，500μ1/ L Si lwe 11)悬浮后，导入小烧杯中用于转化。转化时将GK377A01拟南芥的花在溶液中浸泡 lmin左右，浸泡结束后，将PCB302-3-P1CYP82放倒并将每个花枝与其他花枝分开，避光保温 保湿过夜。侵染后得到To代转PCB302-3-P1CYP82拟南芥种子。
[0066] E:转PCB302-3-P1CYP82拟南芥的筛选及分子鉴定
[0067] 将2000个To代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥种子消毒灭菌后，点种于MS+Kan(50mg/ L)平板筛选，获得1〇棵To代转PCB302-3-P1CYP82拟南芥。
[0068] 从To代转pCB302-3-PlCYP82拟南芥收获种子、播种，得到1^代转pCB302-3-PlCYP82 拟南芥。
[0069] 提取Ti代转P1CYP82拟南芥的cDNA为模板，利用P1CYP82F2: ATGGATTCCCATGTCCCAAC 和 P1CYP82R2: TCAAAGGCTTTCATAAAGCATCA 为引物对，进行 PCR 扩增； [0070] 电泳结果如图4所示，M:Trans2K DNA marker;WT为GK377A01拟南芥，1-3为Τι代转 P1CYP82拟南芥，得到阳性Τ!代转P1CYP82拟南芥，表明P1CYP82已转到野生型拟南芥中。1^代 植株进行PCR鉴定表明凡是经过筛选成活的全被检测为阳性。
[0071] 从1^代转PCB302-3-P1CYP82拟南芥收获种子、播种，得到T2代转PCB302-3-P1CYP82 拟南芥。
[0072] 2.回补P1CYP82拟南芥植株产生ΤΜΤΤ [0073] Α:拟南芥的气体收集
[0074]为了避免土壤中挥发物的影响，利用ddH20将土洗净后，将植物放入玻璃瓶中，并 灌满ddH20以保证植物正常生长。利用顶端开小口的玻璃容器、密闭的铝质金属底座以及金 属夹子组装成相对封闭的系统，对拟南芥进行气体收集。按照密闭的原则组装装置，使气体 利用真空栗通过炭柱过滤后进入装置，含有吸附剂的玻璃管连接于出气口。进气的流速 (60〇1111/111；[11)略大于出气的流速(4001111/111；[11)。
[0075]选择播种后第28天的T2代转P1CYP82拟南芥进行气体采集。鉴于拟南芥植株较小， 挥发物较少，吸附剂在开花前期采用50mg Tenax ΤΑ聚合物，开花后采用50mgPorapaK Q聚 合物。Tenax玻璃管使用前利用5ml重蒸乙醚清洗3次后，在持续的氮气通过的条件下220°C 加热2h;PorapaK Q玻璃管则使用前利用lmL超纯乙醚清洗3次以上后，在持续的氮气通过的 条件下132°C加热2h。气体收集完毕后，Tenax玻璃管直接用于GC-MS分析，PorapaK Q玻璃管 则需要利用250μ1重蒸乙醚洗脱2次(共500μ1)至安捷伦玻璃瓶中待用。以GK377A01拟南芥 和野生型拟南芥（Columbia型）为对照。分别得到T2代转P1CYP82拟南芥挥发物样品、 GK377A01拟南芥挥发物样品和野生型拟南芥挥发物样品。
[0076] Β:用GC-MS对过表达P1CYP82基因、野生型和GK377A01拟南芥植株的
[0077] ΤΜΤΤ的释放量的比较分析
[0078] 用GC(Agilent公司6890Ν，色谱柱参数：长50m X内径0 · 32mmX薄膜厚度0 · 52μπι的 非极性色谱柱；电离参数:70eV，220°C ;气相色谱炉温度保持在30°C 1分钟，然后编程在5°C/ min升温至150°C，接着10°C/min升温至150°C)对T2代转P1CYP82拟南芥挥发物样品、 GK377A01拟南芥挥发物样品和野生型拟南芥挥发物样品进行检测，对人工合成的ΤΜΤΤ标准 样品也按该方法来处理，建立标准曲线。
[0079] 结果如图5所示，其中，5Α为Τ2代过表达P1CYP82拟南芥挥发物在24.01min的GC峰 图；5B为野生型拟南芥挥发物的GC峰图；5C为GK377A01拟南芥挥发物样品GC峰图；5D为ΤΜΤΤ 标样在24. Olmin的GC峰图。对人工合成的ΤΜΤΤ标准样品进行对比后显示挥发物结果为ΤΜΤΤ (图5)。通过定量分析，发现转P1CYP82拟南芥挥发物中ΤΜΤΤ的含量明显增多（图6)。
[0080] 实施例6. P1CYP82在吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫中的应用
[0081] 用Υ型嗅觉仪检测上述花期各植株挥发物对小菜蛾绒茧蜂雌虫行为的影响，具体 如下：
[0082] 小菜蛾绒茧蜂在光照培养箱中用二化螟饲养，挑选小菜蛾绒茧蜂雌虫进行行为研 究。Υ形嗅觉仪主臂20cm，两侧臂15cm，侧臂间夹角60°。通过LS-2800型气栗推动空气进入系 统，气流经活性炭、蒸馏水净化加湿后通过玻璃转子流量计进入Y形管两侧，流速控制在 0.5L/min。测试时，把P1CYP82转基因拟南芥植株放到一个玻璃罐中，作为气味源，放入某一 侧臂，以GK377A01拟南芥作为对照放入另一侧臂。从基管端部接入寄生蜂，每头寄生蜂观察 5min，如寄生蜂爬过侧壁1/3处并停留lmin以上记为对该物质有反应，否则记为无反应。测 试温度为(25 ± 2) °C。重复3次，每次测试30头寄生蜂。
[0083]结果如图7所示，为Y型嗅觉仪检测转P1CYP82的拟南芥挥发物对小菜蛾绒茧蜂雌 虫的行为反应的影响，结果显示，经卡方测验转基因株系与野生型对照植株差异极其显著 (x2 = 36.54，P〈0.01)。说明T2代转P1CYP82挥发物拟南芥样品对小菜蛾盘绒茧蜂具有显著的 吸引作用。
【主权项】
1. 一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因蛋白，其具有如SEQ ID N02所示的氨基 酸序列。2. 权利要求1所述的蛋白的编码基因。3. 根据权利要求2所述的编码基因，具有如SEQ ID N01所示核苷酸序列或SEQ ID N01 中第71-1657的核苷酸序列。4. 含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。5. 权利要求4所述的重组载体，为将权利要求2或3所述的编码基因插入到表达载体中， 得到表达所述蛋白的重组载体。6. 根据权利要求5所述的重组载体，所述编码基因具有SEQ ID N01所述的序列，该序列 插入真核表达载体PYES2的限制性内切酶BamH I和Nhel位点。7. 权利要求4所述的重组菌，为将权利要求6或7所述的重组载体导入目的菌得到的重 组菌，所述目的菌具体为酵母菌株WAT21。8. 根据权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述编码基因或权利要求4-7任一重组 载体或重组菌在生物合成DMNT和TMTT以及吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，为将表达的CYP450基因蛋白加入到以（E)-橙花叔醇和 (E，E)_香叶基芳樟醇为底物的体外酶促反应体系中，得到DMNT和TMTT。
【专利摘要】本发明涉及一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用，属于植物分子生物领域，本发明提供的蛋白如SEQ？ID？NO2所示的氨基酸序列。本发明的实验证明，本发明得到立马豆PlCYP82的cDNA核酸序列及PlCYP82编码蛋白序列；在酵母WAT21细胞中表达的PlCYP82蛋白具有催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇的活性；采用浸花法获得转PlCYP82基因拟南芥，结果表明转PlCYP82的拟南芥植株可显著吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/53, C12N15/81, C12N1/19, C12N9/02
【公开号】CN105647880
【申请号】
【发明人】王桂荣, 李峰奇, 杨婷, 刘杨
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月4日