一个参与dmnt和tmtt生物合成的cyp450基因及其编码产物与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及DMNT和TMTT化合物合成相关的蛋白， 编码其的基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 在植物的众多化合物中，有一些是挥发性物质。植物挥发物在植物抵御虫害的过 程中发挥着重要的作用。当植物受到害虫的危害之后，植物会感知到，并通过合成释放挥发 性物质来趋避害虫或引诱植食性昆虫的天敌来减轻害虫危害，从而提高植物的抗虫性。萜 烯类挥发物包括单萜类，倍半萜类，二萜类和萜烯同系物(E)-4,8-二甲基-1，3,7-壬三烯 ((E)-4，8-dimethy 1 -1，3，7-nonatriene，DMNT)和（E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳 四烯（（E，E)-4，8，12-trimethy ltrideca-1，3，7，11-tetraene，TMTT)等。DMNT 和 TMTT 是植物 花香挥发物和害虫诱导挥发物中最常见的一类，这两种物质在单子叶植物和双子叶植物中 广泛存在，包括杨树和胡桃树等树种，还有玉米、拟南芥、棉花、利马豆、黄瓜、番茄和大白菜 等作物。DMNT和TMTT在生态系统能吸引多种害虫的寄生性天敌和捕食性天敌，如智利小植 绥螨、微红盘绒茧蜂和盔奥啮小蜂等。此外，DMNT和TMTT能诱导或预警未被危害的邻近植物 或同一植物内的防御反应。
[0003] DMNT和TMTT的前体分别为(E)-橙花叔醇和(E，E)_香叶基芳樟醇。但是，把橙花叔 醇和香叶基芳樟醇转化为DMNT和TMTT的关键酶很久都未解决。氘标记的代谢物探针研究表 明叔醇通过碳碳骨架沟的氧化反应而形成萜烯同系物。通过拟南芥的共表达数据库鉴定出 一批在多种压力胁迫下与香叶基芳樟醇合成酶基因共表达的P450基因，该方法结合对诱导 处理叶片的RT-PCR研究，鉴定到一个候选的P450基因。通过酵母表达和对拟南芥突变体株 系的回补实验研究，发现植物的CYP82家族成员CYP82Gl(At3g25180)负责着拟南芥TMTT的 合成。
[0004] CYP450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一个保守的血红 素结合域，是鉴定该基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个CYP450基因，拟南芥基 因组注释显示有457个CYP450基因，如此庞大的基因家族反映了植物次生代谢物的复杂多 变。各种CYP450酶催化的反应广泛并且复杂，包括羟基化、N-、0-和S-端的脱烷基化、环氧基 化、脱氨基作用、脱硫、脱卤作用和过氧化反应等。尽管催化反应各异，催化机理却相同，即 通过NADPH或者NADH为CYP450传递电子，激活氧分子，将其中的一个氧插入到底物上，同时 生成一分子水。CYP450酶作为萜类、黄酮类、脂肪酸类和植物激素等合成代谢途径的一类重 要酶蛋白，不但催化相关代谢反应，由于大多数的CYP450蛋白均有一段内质网膜定位蛋白， 因此在代谢区室(Metabolon)的酶复合体中还具有固定酶复合体的作用。随着分子生物学 以及相关检测技术的不断发展，次生代谢途径相关的CYP450基因功能逐渐得以验证。真核 表达、原核表达以及RNA干扰(RNA Interference)等技术在CYP450基因的功能验证中发挥 了重要作用。近年来利用真核表达使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物挥发物等代谢途径 中的重要作用逐渐被解析。但是作为在植物次生代谢中发挥作用的CYP450表达量相对较 低，并且大多C Y P 4 5 0蛋白具有严格的催化底物结构特异性，同时基因组中广泛存在的 CYP450基因为次生代谢相关基因的克隆和功能验证提供了难度，使之成为了近年来国际学 术界的研究热点之一。
[0005] 到目前为止DMNT和TMTT合成通路只有在拟南芥中被解析。在其他物种中的研究尚 停留在化合物鉴定和行为学研究方面，尚未有IMNT和TMTT合成通路基因被报道。特别是在 农业生产中重要的植物，如蔬菜和农作物等方面的研究更为有限，这限制了我们对于DMNT 和TMTT合成通路的认识，也限制了 DMNT和TMTT在绿色农业生产中的应用。这极大的限制了 DMNT和TMTT在农作物中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一个立马豆DMNT和TMTT生物合成代谢途径的CYP450基因 P1CYP82，其编码的蛋白在含有NADPH的缓冲体系中能催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_香叶基芳 樟醇生成DMNT和TMTT。
[0007] 本发明提供了一种与DMNT和TMTT合成代谢有关的基因 P1CYP82,它是序列表中SEQ ID N〇:l所示的DNA序列。以及一种由上述基因 CYP450编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID No: 2的氨基酸残基序列以及具有SEQ IDNo. 2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ IDNo. 2 衍生的蛋白质。
[0008] 本发明SEQ ID No. 1的DNA序列由1713个碱基组成，其中71-1657的碱基编码528个 氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQ ID No.2。
[0009] 含有本发明基因 P1CYP82的表达载体、细胞系及宿主菌和使用该基因在调节和生 产植物DMNT和TMTT化合物及植物抗虫育种中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0010] 将SEQ ID No.l基因克隆到真核表达载体PYES2的限制性内切酶BamH I和Nhel位 点间，构建带有P1CYP82基因的重组表达载体PESC-TRP-P1CYP82;转入酵母菌株WAT21表达 宿主菌采用半乳糖诱导表达。通过提取表达菌株微粒体，加入到以(E)-橙花叔醇和(E，E)_ 香叶基芳樟醇为底物的体外酶促反应体系中，正己烷萃取反应产物，GC-MS分析。GC-MS分析 结果表明（E)-橙花叔醇和(E，E)_香叶基芳樟醇在P1CYP82蛋白酶的催化下，生成了新的物 质，通过分析新产物的分子离子峰与DMNT和TMTT标样对比，认为该产物为DMNT和TMTT。
[0011] 研究结果表明，本发明与立马豆DMNT和TMTT合成有关的基因具有细胞色素 P450基 因的特征结构域，酶促反应分析发现该基因催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_香叶基芳樟醇形成 防御性挥发物DMNT和TMTT，对于调节和生产植物DMNT和TMTT挥发物及培育新的抗虫作物具 有重要的理论及实际意义。
【附图说明】
[0012] 图1.立马豆P1CYP82基因的PCR克隆
[0013] M:DNA分子量标准(D2000) ;P:PCR产物
[0014] 图2.重组质粒 pESC-TRP-PlCYP82 的 PCR 鉴定
[0015] M:DNA分子量标准(D2000) ;P:PCR产物
[0016] 图3.利马豆P1CYP82基因在酵母中反应产物的GC-MS图
[0017] P1CYP82 基因以（E)-Nerolidol 和(E，E)-Geranyllinalool 为底物的酵母反应产物 (A和C);空载体以（E)-Nerolidol和^3)-66抑1^111的1〇〇1为底物的酵母反应产物(8和 D);1.DMNT;2. (E)-Nerolidol;3.TMTT;4. (E，E)-Geranyllinalool;E:DMNT产物质谱图；F: DMNT标样质谱图;G:DMNT产物质谱图;H:TMTT标样质谱图。
[0018] 图4.转P1CYP82拟南芥的分子检测
[0019] M: DL2000marker · 1-3是拟南芥转基因阳性植株，4是野生型拟南芥，5是GK377A01 拟南芥植株。
[0020] 图5.过表达P1CYP82基因、野生型和GK377A01拟南芥植株的挥发物分析
[0021] A:过表达P1CYP82基因拟南芥植株;B:野生型拟南芥植株;C: GK377A01拟南芥植 株;D:TMTT标样。
[0022] 图6.过表达P1CYP82基因、野生型和GK377A01拟南芥植株的TMTT释放量
[0023] A:过表达P1CYP82基因拟南芥植株;B:野生型拟南芥植株;C: GK377A01拟南芥植株
[0024]图7.小菜蛾绒茧蜂雌虫对过表达P1CYP82基因拟南芥植株和野生型拟南芥植株的 选择
[0025]具体实施例方式
[0026] 实施例1.立马豆总RNA的提取和cDNA的合成
[0027] 立马豆的总RNA的提取参照天根生化科技有限公司RNA simp 1 e总RNA提取试剂盒 中的说明手册提取。琼脂糖凝胶电泳检测并通过NanoDrop测定浓度。cDNA第一链的合成采 用TAKATA公司的primer scriptTM 1st strand cDNA Synthesis System反转录试剂盒，方 法参照试剂盒中的说明手册。同时，为了获得基因全长，用SMARTerTMRACE cDNA扩增试剂盒， 进行cDNA的合成，方法参照试剂盒中的说明手册。
[0028]实施例2.引物设计与基因克隆
[0029] 根据拟南芥CYP82基因（at3g25180)，在菜豆基因组网站http:// phytozome. jgi . doe. gov/pz/portal .html# ； ! info?alias = 0rg_Pvulgaris VI · 0上进行 blast，获得立马豆CYP基因部分保守序列。根据该基因的序列设计保守引物，通过RACE技术 在克隆立马豆中的同源基因。5RACE primerl :TCCTGAAATAGGGTATTCTAGCATT;5RACE primer2:CGGGT