ACTTTGGTGCCCTTTTTAGG；3RACE primer1:GGCATGACATTTGGGCTGCAAGTGC； 3RACE primer2:GTTAGGAGTGGCTTTGCCTAAAGAA，引物由北京华大基因公司合成。通过巢氏 PCR获得基因全长。
[0030] 立马豆种子，公众可从中国农业科学院植物保护研究所获得。
[0031] 以立马豆的cDNA为模板，通过RACE扩增，得到1713bp的PCR产物（图1)(含70bp的5 ' UTR和56bp的3'UTR序列）。目的片段利用TA克隆的方法连接到T-easy载体(购自北京全式金 公司）后，构建成P1CYP82测序载体，经过测序(序列见SEQ ID N01)，该1713bp的PCR产物含 有的基因编码区位于第71-1657位，将该基因命名为P1CYP82,该基因编码的蛋白命名为 P1CYP82;该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID N02,共528个氨基酸。经过序列比对， 卩1〇￥?82与拟南芥&丨3825180基因核苷酸的相似性为43%。
[0032] P1CYP82测序载体为将序列表中的序列1插入T-easy载体得到的载体。
[0033] 实施例3.P1CYP82在合成TMTT和DMNT中的应用
[0034] 1.载体构建
[0035] 以T-P1CYP82测序载体为模板，利用高保真酶TranStartFastPfu DNA Polymerase 及引物P1CYP82F1 ( 5 ' -GATCGGACTACTAGCAGCTGTAATACGACT-3 '）/PlCYP82Rl (5 ' -GGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCG-3'），得到1713bp的带有A末端的目的片段(具有序列表中序 列1的核苷酸）。将上述带有A末端的目的片段参照全式金生物有限公司pEASY-El Expression Kit说明书与载体pEASY-El连接，得到的连接产物转入普通大肠杆菌后涂于含 Amp (50mg/ml)的LB平板上过夜培养。
[0036] 挑取单克隆利用T7F(5'-TAATACGACTCACTATA-3'）及目的基因下游引物P1CYP82R1 进行检测，得到阳性克隆。将阳性克隆提取质粒送去测序，该质粒为将序列表中序列1自5' 末端第71-1657位核苷酸利用TA克隆的方法插入载体pESC-TRP的BamH I和Nhel酶切位点间 得到的载体，命名为pESC-TRP-P 1CYP8 2。
[0037]将PESC-TRP-P1CYP82转化DH5a感受态细胞，转化过程见天根生化科技(北京)有限 公司DH5a感受态细胞说明书，将DH5a/pESC-TRP-PlCYP82利用目的基因特异引物进行PCR检 测，证明pESC-TRP-P 1CYP82已转入大肠杆菌中（图2)。
[0038] 2.P1CYP82蛋白的诱导表达
[0039] 采用Clontech公司提供的LiAc/ssDNA/PEG法制备酿酒酵母感受态细胞并进行重 组质粒的转化。将构建的PESC-TRP-P1CYP82质粒转化表达宿主菌WAT21，获得的酵母转化子 经菌液PCR检验，20ul反应体系为:Easy Taq DNA聚合酶0.2ul、10倍buffer 2ul，d NTP混合 物1.6111(2.5111111〇1/1)、？10￥?82基因的上下游引物各0.5111(10.011111〇1/1)，经玻璃珠破壁处 理的模板适量，用ddH 20补足至20ul。反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸1.5min，32个循环，最后72°C延伸lOmin。选取PCR检验为阳性的菌落进行下 一步试验。以转入pESC-TRP空载体的酿酒酵母作为对照。将酵母阳性克隆接种到5mL含2% 葡萄糖的SC-TRP液体培养基中，于300C，300r/min过夜培养，10mL体积扩大培养至OD600达到 0.8,3次重复，培养物于4°(：110(^离心51^11，细胞沉淀用等体积(1(1!1 20洗涤3次后换用含2% 半乳糖的SC-TRP液体培养基重悬，所得菌体制成微粒体用于进行酶活检测。
[0040] 在含有PESC-TRP-P1CYP82表达蛋白微粒体的缓冲体系加入NADPH和底物(E)-橙花 叔醇和(E，E)-香叶基芳樟醇进行催化反应，缓冲体系包括50mM的Tric-HCl (PH 7.4)、ImM的 EDTA、0.6M的山梨醇、20%的甘油，111^熟0?!1和4(^1底物化)-橙花叔醇和化3)-香叶基芳樟 醇，另外在PH范围7.4-8.0的缓冲体系中均有相同的功能。催化反应温度20-40度之间，15分 钟以上。反应完全后用正己烷萃取催化产物，进行GC-MS分析。取ΙμL样品进样，利用气质联 用系统GC-MS (ΗΡ6890/ΗΡ5973，Hewlett-Packard公司），色谱柱HP-5MS (60m X 250μπι X 0 · 25μ m;Hewlett_Packard公司），GC_MS仪器进行分析。升温程序为:40°C保持lmin，以5min5°C的 增量升到250 1€(1°(：/1^11)，最后250°(：保持171^11(^检测范围为40-550，温度为170°(：。结果 发现以（E)-橙花叔醇和(E，E)_香叶基芳樟醇为底物，包含有P1CYP82基因重组表达载体 PESC-TRP-P1CYP82催化组与空载体对照以及其他基因表达载体反应产物相比有新物质产 生（图3)，气质谱图如图3,与DMNT和TMTT质谱图相一致，产物鉴定为DMNT和TMTT。说明 CYP450基因编码的蛋白在DMNT和TMTT合成代谢途径中能催化(E)-橙花叔醇和(E，E)_香叶 基芳樟醇生成DMNT和TMTT(图3)。
[0041 ] 实施例5.P1CYP82在拟南芥挥发TMTT中的应用 [0042] 1.转P1CYP82回补拟南芥at3g25180突变体的获得
[0043] 1)表达载体的构建
[0044] 对目的基因引物P1CYP82F2 : ATGGATTCCCATGTCCCAAC和P1CYP82R2 : TCAAAGGCTTTCATAAAGCATCA增加 Spe I和Sst I酶切位点，以立马豆cDNA为模板，利用高保真 酶进行扩增。PCR反应体系为5XTans FastPfu Buffer 10yl，dNTP(2.5mmol · Ι-Ι'δμL， TansFastPfu DNAPolymerase ΙμL,Forward primer(lOymol · L_1)lyKReverse primer(10 μπιο? · 1-1)141'0财1以1，用(1(1!12〇补足至5(^1。？0?的反应条件为951€21^11 ;951€2〇8,6〇1€ 2〇8,72°(：158,40个循环 ；721€5111丨11;4°(：保存。
[0045] 1%琼脂糖凝胶电泳，结果为得到1587bp的PCR扩增产物，切胶回收，得到回收片 段。将PCB302-3过表达载体质粒与回收片段同时利用Spe I和Sst I进行4h双酶切，该载体 含有CaMV35S启动子，可驱动目的基因的过量表达。连接载体的酶切体系为10XNEB Buffer45yl，100XBSA 0.5yl，PlCYP82质粒或回收片段2yg，Spe Ilyl，Sst Ι?μL，用ddH20 补足至50μ1。纯化回收酶切产物。T4连接酶4°C过夜连接，连接体系为pCB302-3片段3μ1，目 的基因酶切片段2μ1，10 X Buffer ΙμL，T4DNA LigaseO · 5μ1，用ddH20补足至10μ1。连接产物 转化大肠杆菌后，得到转化子。提取转化子的质粒，用引物P1CYP82F/R进行PCR检测、酶切鉴 定，测序结果表明该质粒为将序列表中序列1自5'末端第71-1657位核苷酸插入pCB302-3的 Spe I和Sst頂每切位点得到的质粒，将该质粒命名为PCB302-3-P1CYP82。
[0046] 2)农杆菌介导的拟南芥转化(浸花法）
[0047] A:拟南芥at3g25180突变体
[0048] 拟南芥at3g25180的T-DNA插入突变体，编号为GABIKat(GK)377A0lUNASC (uropean Arabidopsis Stock Centre)购买获得。该突变体的回补实验可用于证实TMTT通 路上P450候选基因的功能，详细请参考Lee S，Badieyan S，Bevan D R，et al.Herbivore-induced and floral homoterpene volatiles are biosynthesized by a single P450enzyme(CYP82G1)in Arabidopsis.Proceedings of the National Academy of Sciences ,2010,107(49) :21205-21210·选择纯合的GK377A01突变体用于基因回补实验。
[0049] B:农杆菌电击感受态的制备
[0050] (1)挑取农杆菌AGL1单菌落接种到lml的LB液体培养基中，短暂涡旋使细胞充分悬 浮，将悬浮液接种到l〇ml含梭苄霉素400mg/L的LB液体培养基中，28°C，250rpm震荡培养过 夜；
[0051 ] (2)将10ml已培养的菌液接种到100ml含400mg/L羧苄霉素的LB液体培养基中，28 °C，250rpm震荡培养，在0D值为0.5左右时，进行操作；
[0052] (3)将在冰上静置30min后菌液的，在4°C条件下，4000rpm离心10min，去上清，加入