克隆抗体I-ELISA检测方法的建立
[0118] 采用方阵法确定蛋白的最佳包被浓度及阳性血清的最佳稀释倍数，根据棋盘I-ELISA阳性血清孔的OD45〇nm值接近1 · 0，阴性血清OD45〇nm值小于0 · 2，P/N>2 · 0，确定抗原抗 体最佳稀释度。重组蛋白rGopET-30a-CD4eX最佳稀释度为1:200，90ng/孔包被，阴阳性血清 最佳稀释度为1: 1〇〇,如表1，I-ELISA试验各影响因素条件的确定，如表2。
[0119] 全细胞ELISA反应程序为:每孔lOOyL检测抗原（1 X 106个/孔），置于37°C恒温培养 箱中孵育16~24h，TOST洗涤两次，5 %脱脂乳-PBST 300yL/孔，37°C封闭2~4h，PBST洗涤两 次;加入l〇〇yL杂交瘤细胞上清，37 °C孵育lh，PBST洗涤两次;加入1:5000倍稀释的山羊抗鼠 二抗，37°C孵育lh，PBST洗涤两次后加入100μL孔TMB显色液，避光显色15min后，用1M H2S〇4 50yL/孔，终止反应。用酶标测定仪在波长450nm处测定每孔的光吸收(OD45〇nm)值。
[0120]表1抗原抗体最佳反应条件的确定
[0121]
[0123] 表2间接ELISA各个影响因素最佳反应条件的确定
[0124]
[0125] 1.2杂交瘤细胞株的建立
[0126] 免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经HAT培养液选择性培养， 在第3天开始出现融合细胞。选择经几次特异性检测并且0D 45Qnm值持续上升的5A9株杂交瘤 细胞株。经3~4次亚克隆，获得能稳定分泌抗鹅CD4胞外区蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞 株，命名为5A9，将该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏号是:CGMCC N0.11192。
[0127] 2分泌抗鹅⑶4胞外区单克隆抗体杂交瘤细胞株(CGMCC N0.11192)的鉴定
[0128] 2.1杂交瘤细胞株染色体计数分析
[0129] 骨髓瘤细胞染色体数目为55~65条，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40条，本发 明得到5A9株杂交瘤细胞株的染色体数目为107条，在90~110条之间，SP2/0为55条左右在 正常染色体55~65条之间。该值大于脾细胞染色体数目的2倍，表明杂交瘤细胞确为脾细胞 与骨髓瘤细胞融合而成，如图4。
[0130] 2.2杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析
[0131] 将筛选的阳性杂交瘤细胞株扩大培养并传 16代，收集每代的细胞上清，通过建立 的I-ELISA方法检测细胞上清的OD45〇nm值，结果发现5A9分泌抗体的稳定性均较好，如图5。
[0132] 3抗鹅⑶4胞外区单克隆抗体的特性鉴定
[0133] 3.1单克隆抗体亚类鉴定
[0134] 根据单抗Ig类/亚类鉴定用试剂盒进行鉴定，5A9单克隆抗体亚类为IgG2a。
[0135] 3.2单克隆抗体效价的测定
[0136] 根据建立好的I-ELISA方法，将抗rGopET-30a-CD4eX单抗5A9按2倍倍比稀释测效 价，鼠阴阳性血清1:100稀释作对照，5A9效价为1:2097152，如图6。
[0137] 3.3单克隆抗体特异性的I-ELISA鉴定
[0138] 将重组蛋白rGopET-30a-CD4eX及鹅T淋巴细胞根据建好的I-ELISA方法包被，结果 发现5A9均能与重组蛋白及鹅外周血T淋巴细胞反应，如图7。
[0139] 3.4单克隆抗体特异性的Western blot鉴定
[0140] Western blot结果显示5A9能与重组蛋白rGopET-30a_CD4ex发生特异性反应，条 带大小为54KDa，如图8。且5A9可以与鹅外周血T淋巴细胞中的⑶4分子发生特异性反应，条 带大小约为50KDa左右，比预测的天然的⑶4分子大小稍偏低，如图9。
[0141] 3.5单抗特异性的IFA鉴定
[0142] 5A9单克隆抗体与转染真核表达质粒pcDNA3.1-⑶4ex的鸡胚成纤维细胞反应，产 生较强的绿色荧光信号，而pcDNA3.1( + )空质粒转染的鸡胚成纤维细胞与单抗并未产生荧 光信号，表明5A9单克隆抗体可特异性识别鹅CD4分子，如图10。
[0143] 3.6单抗的相对亲和常数测定
[0144] 利用硫氰酸盐洗脱法测得5A9单克隆抗体的相对亲和常数为3mol/L，具有中等强 度的亲和力，如图11。
[0145] 实施例3抗鹅CD4胞外区单克隆抗体在检测禽类CD4+T淋巴细胞中的应用
[0146] 方法：
[0147] 1激光共聚焦检测抗鹅CD4胞外区单克隆抗体交叉反应性
[0148] 常规方法制备鹅、鸭、鸡外周血淋巴细胞，收集细胞后，PBS洗涤3次后，进行细胞计 数，每个瓶皿中加入细胞1 X 1 〇6个，分散均匀，利用4 %的多聚甲醛固定过夜;次日PBS洗涤3 次，利用0 · 5%Triton-X-100对细胞通透20min，PBS洗涤3次；加入经PBA(含1 %BSA的PBS缓 冲液）1:200倍稀释的5A9单抗腹水，37 °C作用lh，PBS洗涤3次;加入1:200倍稀释的FITC标记 的山羊抗鼠 IgG抗体为二抗，37°C避光作用45min，PBS洗涤3次;利用0.5mg/mL的DAPI进行细 胞核染色，37°C作用30min后，PBS洗涤3次，激光共聚焦显微镜下观察荧光信号的产生情况。
[0149] 2流式细胞术分析抗鹅CD4胞外区单克隆抗体交叉反应性
[0150] 常规方法制备鸡、鸭、鹅外周血淋巴细胞，收集细胞后，PBS洗涤3次，进行细胞计 数，每个EP管中加入细胞5 X 105个，1000r/min离心5min;分别加入经PBA(含1 %BSA的PBS缓 冲液)1:100倍稀释的纯化5A9单抗腹水，重悬细胞，4°C作用lh，PBS洗3次;加入1:100稀释的 FITC标记的山羊抗鼠 IgG抗体为二抗，4°C避光作用45min，roS洗3次；用200yL PBS将细胞悬 起后，流式细胞仪FACS Aria(FACS Diva软件)分析。
[0151] 结果：
[0152] 1激光共聚焦检测抗鹅CD4胞外区单克隆抗体交叉反应性
[0153] 常规方法收集鹅、鸭、鸡外周血淋巴细胞，将稀释好的纯化的5A9单克隆抗体腹水 适量加入细胞中，结果发现5A9单克隆抗体不仅鹅T淋巴细胞反应，而且与鸭、鸡T淋巴细胞 也均有交叉反应性，如图12,说明制备的单克隆抗体5A9可以用于检测鹅、鸭以及鸡的T淋巴 细胞。
[0154] 2流式细胞术检测抗鹅CD4胞外区单克隆抗体交叉反应性
[0155] 经过流式细胞术分析健康状态良好且未经免疫的成年鹅的CD4+T淋巴细胞所占淋 巴细胞的29.3 %，成年鸭的⑶4+T淋巴细胞所占淋巴细胞的28.3 %，成年鸡的⑶4+T淋巴细胞 所占淋巴细胞的13.4%，分别与各自阴性对照相比5A9单克隆抗体检测的T淋巴细胞出现了 明显的阳性峰，说明5A9单抗均可以用于检测鹅、鸭、鸡外周血中的CD4+T淋巴细胞，如图13。
【主权项】
1. 一种分泌抗鹅CD4胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于所述的杂交瘤细 胞株命名为5A9,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是： CGMCC NO.11192。2. 由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生的抗鹅CD4胞外区单克隆抗体。3. 权利要求2所述的抗鹅CD4胞外区单克隆抗体在制备检测禽类外周血中CD4+T淋巴细 胞试剂中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述禽类包括鹅、鸭以及鸡。
【专利摘要】本发明公开了抗鹅CD4胞外区单克隆抗体及其在检测禽类外周血中CD4+T淋巴细胞中的应用。本发明利用携带鹅CD4胞外区的原核表达载体pET-30a-CD4ex，采用大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS表达鹅CD4胞外区基因，得到重组蛋白rGopET-30a-CD4ex。以重组蛋白rGopET-30a-CD4ex为免疫原，免疫三次BALB/c小鼠，加强免疫后，经重组蛋白rGopET-30a-CD4ex筛选获得1株稳定分泌抗鹅CD4胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5A9，保藏号是：CGMCC？NO.11192。研究表明，由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能与纯化的重组鹅CD4胞外区蛋白rGopET-30a-CD4ex反应，同时也能够与分离的鹅、鸭以及鸡外周血淋巴细胞发生特异性反应。因此，本发明的提出为检测禽类外周血中CD4+T淋巴细胞提供了一种新的、有效的技术手段。CGMCC NO.1119220150914
【IPC分类】C12N5/20, C07K16/28, G01N33/577, G01N33/569
【公开号】CN105647875
【申请号】
【发明人】王君伟, 曹春秋, 马波, 张雪莲, 高明春, 张文龙, 郝春雪, 崔嘉琦
【申请人】东北农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月10日