肤，同时用镊子将小鼠的皮肤 拉向两侧，暴露腹膜，换一套剪镊剪开腹膜，即可看到脾脏。取出脾脏，放入装有不完全1640 培养液的无菌培养皿中，小心剥离附着在脾脏表面的结缔组织和脂肪等。再将脾脏置于另 一无菌培养皿中，加入1640不完全培养液，用镊子在灭菌后的200目的铜网上对脾脏进行研 磨。研磨充分后，收集培养液并转移至50mL离心管中，1000r/min离心15min，重悬细胞，计 数。
[0086] 2.5细胞融合
[0087] 将制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞悬液，按脾细胞:SP2/0 ? 8:1~10:1之间的比例 混合，加于50mL离心管中，1000r/min离心15min，弃上清，轻弹离心管底，使细胞沉淀充分混 匀成糊状，将离心管垂直置于盛有3 7 °C预热的蒸馏水的烧杯中。吸取1 m L 3 7 °C预热的融合 剂PEG3350，边滴入细胞中边轻轻摇动离心管，轻轻混匀，lmin内加完。静置90s，在lmin内缓 慢滴入37°C预热的不完全1640培养液lmL，边滴边轻轻转动离心管，再重复一次，随后在30s 内加入lmL不完全1640培养液，2min内加完7ml预热的不完全1640，1000r/min离心10min离 心，弃上清。HAT选择培养液将沉淀细胞悬起，混合均匀。将细胞悬液接种于已加有饲养细胞 的96孔细胞培养板中，每孔100yL，将培养板移至37°C 5 % C02培养箱中培养。
[0088] 2.6阳性杂交瘤细胞株的筛选
[0089] 每5-7天，采用半换液方式对融合后的细胞进行培养液的更换。待杂交瘤细胞长满 孔底1/3~1/2时，取出细胞培养上清100uL，用建立的I-ELISA筛选方法对上清进行检测，同 时用SP2/0上清作阴性对照，并设阳阴性鼠血清对照，以P/N 2 2.0为判定标准，对阳性孔进 行克隆。
[0090] 2.7杂交瘤细胞的克隆、冻存与复苏
[0091] 将I-ELISA检测为阳性孔的杂交瘤细胞集落悬起混匀，采用有限稀释法，吸取一定 量细胞至无菌小青瓶中进行稀释，稀释至10mL含100个细胞，将稀释好的细胞悬液以每孔 100yL加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。经过2~4次克隆，直至所有克隆化细 胞孔阳性率为100%时，即可确定已获得分泌抗鹅CD4胞外区单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0092] 杂交瘤细胞株冻存时，将培养瓶中生长旺盛的杂交瘤细胞利用吸管进行反复吹 打、分散均匀后，置于10mL离心管中，1000r/min离心5min，弃掉培养液，收集细胞，用1.5mL 细胞冻存液将细胞重悬，加入到细胞冻存管中，做好标记后直接放入细胞程序冻存盒中，先 放于-70°C冰箱中，而后投入液氮容器中。
[0093]杂交瘤细胞复苏时，从液氮容器中取出冻存管，迅速放入37°C水浴中，摇动使其在 lmin内迅速融化，而后500r/min离心5min，弃掉冻存液，用完全1640培养液将细胞沉淀悬 起，加入到事先盛有适量培养液的细胞培养瓶中，37 °C 5 % C02恒温培养箱内培养，4h~12h 内观察培养瓶中有部分细胞贴壁后，对其进行换液即可。
[0094] 2.8腹水的制备及纯化
[0095] 高压灭菌的液体石蜡，腹腔注射8-12周龄BALB/c小鼠，0.5mL/只，注射后7-10天注 射扩大培养的杂交瘤细胞。利用不完全1640培养液将生长旺盛的杂交瘤细胞吹下来， 1000r/min离心5min，弃去上清。用不完全1640培养液洗涤细胞一次，重悬细胞并计数，调整 细胞浓度为1~2 X 106个/mL，腹腔注射，0.5mL/只，注射后7~10天密切观察小鼠的生长状 态及腹水产生情况，当发现小鼠腹腔有流动性腹水时，及时收集腹水，并以l〇〇〇〇r/min离心 l〇min，弃去油脂和细胞沉淀，吸取澄清液体，分装-70°C保存。
[0096] 腹水纯化，将Protein G填料注入柱子中，轻柔的混合2次，用Binding Buffer A (Na2HP〇4 20Mm NaCl 0·15，ρΗ 7.0)平衡柱子2~3次；再加入Binding Buffer A稀释300yL 腹水约2ml，4°C结合30min，期间每隔10min转动一下柱子，使目的蛋白与填料充分结合;之 后用Elution Buffer B(critric acid 0.1mol，pH 2.0)洗脱目的蛋白，洗脱几次，每次洗 脱后收集的流出液立即用等体积的lmol的Tris base(pH10.3)中和成pH8.0，最后经SDS PAGE检测纯化效果。
[0097] 3分泌抗鹅⑶4胞外区单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定
[0098] 3.1杂交瘤细胞株染色体计数分析
[0099] 在生长旺盛的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，使其终浓度为0.5yg/mL，继续培养4~ 6h。吹下培养瓶中的细胞，将细胞悬液以1000r/min离心10min，弃上清液，加入37°C预热的 5mL 0.075mol/L KC1低渗液，混悬细胞，37°C处理15~20min;加入新配制的固定液（甲醇与 冰醋酸3:1混合）lmL，边滴边混勾细胞悬液，1000r/min离心10min，弃上清液;再加入固定液 5ml将细胞沉淀重新悬浮并混勾，静置30min后，1000r/min离心10min，弃上清液;重复操作 一次后小心吸出上清，保留少许固定液与细胞混匀后吸取1-2滴悬液加至载玻片上;干燥后 吉姆萨染色l〇min;选择染色体分散良好、无重叠、失散的细胞进行镜检观察并计数。
[0100] 3.2杂交瘤细胞株的稳定性分析
[0101 ]对杂交瘤细胞进行体外多次传代，收集每次传代的细胞上清，用建立的I-ELISA检 测方法检测上清〇D45〇nm值，分析杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性。
[0102] 4抗鹅⑶4胞外区单克隆抗体的特性鉴定
[0103] 4.1单克隆抗体亚类鉴定
[0104] 利用单抗Ig类/亚类鉴定用试剂盒进行鉴定，操作步骤参看试剂盒说明书进行。
[0105] 4.2单克隆抗体效价的测定
[0106] 根据建立好的I-ELISA检测方法，取抗rGopET-30a-CD4ex单克隆抗体以1:1、1:2、 1:4等2倍倍比稀释，测定OD4 5〇nm值，以P/N 2 2.0腹水的最大稀释倍数作为其效价值。
[0107] 4.3单克隆抗体特异性的I-ELISA鉴定
[0108] 根据之前建立好的I-ELISA检测方法，将纯化后的重组蛋白rGopET-30a-CD4eX以 及鹅T淋巴细胞同时作为抗原包被酶标反应板，抗鹅⑶4胞外区重组蛋白rGopET-30a-⑶4ex 单克隆抗体作为一抗，并设有阳性、阴性对照，I-ELISA步骤同方法2.1。
[0109] 4.4单抗特异性的Western blot鉴定
[0110] 将纯化后的重组蛋白rGopET-30a-CD4ex及鹅外周血淋巴细胞经SDS-PAGE电泳后 并转印到NC膜上，以抗rGopET-30a-CD4ex单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠 IgG 为二抗，PBST以1:2000稀释，其余步骤同实施例1中方法2。
[0111] 4.5单抗特异性的IFA鉴定
[0112]将本发明发明人构建的真核质粒pCDNA3.1-CD4eX转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。常 规方法制备CEF，铺制48孔板，培养过夜，待细胞生长至60 %-70 %时备用。利用脂质体介导 的方法进行质粒的转染，转染的方法详见转染试剂LTX说明书。转染后4h，弃去培养液，加入 含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养48h。之后用roS洗涤细胞3次，加入适量4%的多聚 甲醛固定30min，PBS洗3次；加入抗rGopET-30a-CD4ex单克隆抗体为一抗，以pCDNA3.1 ( + )空 质粒转染孔做阴性对照，37°C作用2h，PBS洗3次；加入1: 50倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠 IgG抗体为二抗，37 °C避光作用lh，PBS洗3次，荧光显微镜下观察荧光情况。
[0113] 4.6单抗的相对亲和常数测定
[0114] 利用硫氰酸盐洗脱法测定单抗的相对亲和常数，根据之前建立好的I-ELISA检测 方法，按纯化的rGopET-30a-CD4ex蛋白最佳稀释度包被过夜，100μL7孔，次日TOST洗涤3次； 抗rGopET-30a-CD4ex单克隆抗体的饱和浓度为一抗，lOOyL/孔，37 °C作用lh，PBST洗涤3次； 加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5臟〇1不同浓度的恥3^10(^17孔，室温作用 15min JBST洗涤3次;加入1:5000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠 IgG抗体为二抗，100μL7孔， 37°C作用lh，PBST洗涤3次;ΤΜΒ液100μL7孔，显色5~10min，1Μ H2S〇4 50yL/孔终止反应，用 酶标测定仪测定〇D45_i值;结果判定，经硫氰酸盐洗脱后每种抗体与抗原结合的OD45〇nm下 降至未经洗脱的〇D4 5Qnm的50 %时所对应的NaSCN浓度，即为该抗体的相对亲和力常数，用 mol/L表不。
[0115] 结果：
[0116] 1抗鹅CD4胞外区单克隆抗体的制备
[0117] 1.1单