[0041 ] SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存;感受态细胞RosettaTM(DE3)pLysS均由本实验 室制备保存;重组质粒pET-30a-CD4ex(携带鹅CD4胞外区的原核表达载体）由本实验室构建 并保存。
[0042] 1.3主要试剂
[0043] 1.3.1蛋白表达及纯化试剂等
[0044] 蛋白标准Marker购自TaKaRa(大连）公司；IPTG购自北京索莱宝科技有限公司；DAB 显色试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;Ni-NTA亲和层析纯化试剂 盒、Protein G亲和层析纯化试剂盒购自GenScript(南京)生物技术有限公司公司；弗氏佐 剂(FA)、PEG和DAPI购自SIGMA公司；
[0045] 1.3.2抗体制剂
[0046] 兔抗鹅CD4多克隆抗体由本实验室制备保存;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG抗体均购自北京博奥森公司；异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠 IgG购自北 京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠单抗Ig类鉴定试剂盒(C060102)由洛阳佰奥通实验材 料中心研制。
[0047] 1.3.3细胞类制剂
[0048]秋水仙素、人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；HAT、HT选择性培养 基及RPMI1640培养基购自GIBC0公司；Lipofectamine? LTX转染试剂购自美国Invitrogen 公司。青霉素、链霉素购自哈尔滨三精制药厂;胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。
[0049] 实施例1鹅CD4胞外区原核表达及抗原性鉴定
[0050] 方法：
[0051] 1、鹅⑶4胞外区原核表达
[0052] 1.1鹅⑶4胞外区基因的诱导表达
[0053] 将本实验室构建好的重组质粒pET-30a_CD4ex按照常规方法转化至RosettaTM (DE3)pLysS感受态细胞中。次日37°C培养至菌液0D6Q()的值达到0.4-0.6，按0.1 %加入IPTG 至终浓度为lmmol/L，37°C继续培养4h。收获诱导后菌液，4°C、5000r/min离心15min，弃上 清，0.01mol/L PH=7.2PBS重悬菌体。将重悬的菌液利用超声波裂解细胞，4°C、5000r/min 离心15min，分别收集超声上清及沉淀，经12 % SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量及表达形 式，结果为包涵体表达，重组蛋白命名为rGopET-30a-CD4ex。
[0054] 1.2重组蛋白的纯化
[0055]将获得的包涵体蛋白分别与3mL Buffer B(100mM NaH2P〇4;10mM Tris-C1;8M Urea pH 8.0)混合加至已再生好的Ni-NTA柱中，4°C结合4h;收集流出液，然后分别用2ml含 lOmmol、5mmol、lOOmmol等浓度咪唑的Buffer B洗脱目的蛋白，每个梯度洗涤柱子5~6次， 收集洗涤液，而后进行SDS-PAGE分析。
[0056]将纯化后的目的蛋白装入透析袋中，放于含5%甘油的PBS透析液中于4°C透析，每 隔4~6h换液一次，除去尿素。透析后浓缩蛋白样品并利用Bradford蛋白测定试剂盒测定纯 化后蛋白浓度，其余加入20%甘油后，分装保存于-20°C。
[0057] 2、鹅⑶4胞外区重组蛋白抗原性鉴定
[0058] 利用Western blot鉴定重组蛋白的抗原性，将纯化的重组蛋白rGopET_30a-〇)4ex 经SDS-PAGE电泳后并转印到NC膜上，55mA，40min，丽春红染色发现目的条带，PBST洗涤后， 5 %的脱脂乳，4 °C封闭过夜;次日PBST洗涤3次，5min/次，以本发明发明人制备的抗鹅⑶4胞 外区多克隆抗体作为一抗，37°C作用2h，PBST洗涤3次，5min/次;HRP标记的山羊抗鼠 IgG为 二抗，PBST以1:2000稀释，37°C作用lh，PBST洗涤3次，5min/次;DAB避光显色5~15min，观察 目的条带，蒸馏水终止。
[0059] 结果：
[0060] 1、鹅⑶4胞外区基因原核表达
[0061] 1.1鹅⑶4胞外区基因的诱导表达
[0062] 将阳性重组质粒pET-30a_CD4ex转化至Rosetta?(DE3)pLysS感受态细胞中，经 IPTG诱导表达后，获得重组蛋白，重组蛋白rGopET-30a-CD4ex大小约为54KDa，均与预期大 小相符，表达方式为包涵体表达，如图1。
[0063] 1.2重组蛋白的纯化
[0064] 重组蛋白rGopET-30a-CD4ex在变性条件下可被纯化出来，且蛋白在含150mM咪唑 的8M尿素的溶液中被洗脱下来，如图2。
[0065] 2、鹅⑶4胞外区重组蛋白抗原性鉴定
[0066] 重组蛋白rGopET-30a_CD4ex与已制备好的兔抗鹅⑶4胞外区多克隆抗体反应，可 以发现特异性条带，说明重组蛋白具有良好的抗原性，如图3。
[0067]实施例2抗鹅CD4胞外区单克隆抗体的制备 [0068]方法：
[0069] 1动物免疫
[0070]将纯化的后的重组蛋白rGopET-30a-CD4eX作为免疫原，首免时与等体积的弗氏完 全佐剂乳化，其余免疫时与弗氏不完全佐剂乳化，经背部皮下多点注射6周龄BALB/C小鼠 (50ug/只），免疫间隔时间为2周，加强免疫3d后无菌取小鼠脾脏用于细胞融合，收集阴性、 阳性血清用于建立筛选阳性杂交瘤细胞株I -ELI SA。
[0071] 2单克隆抗体的制备
[0072] 2.1单克隆抗体I-ELISA检测方法的建立
[0073]取健康的BALB/c小鼠，作为阴性对照鼠，与免疫小鼠在相同条件下饲养，融合前分 别将免疫小鼠和对照小鼠眼球采血，分离血清，-20 °C保存备用。
[0074]将纯化的重组蛋白rGOpET-30a-CD4ex作为检测原，利用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将 检测原做1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200倍比稀释，每孔100yL，加入微量反应 板，4 °C包被过夜。弃去板中液体，PBST洗涤3次，加封闭液(5 %脱脂乳)300yL/孔，37 °C封闭 2h。弃去板中液体，用TOST洗涤3次，将阳性、阴性血清用TOST分别做1:100、1: 200、1:400、1: 800倍比稀释，lOOyL/孔，同时设空白对照，37 °C作用lh。弃去板中液体，PBST洗涤3次，用 TOST将HRP标记的羊抗鼠酶标二抗以1:5000稀释，每孔100yL，37 °C作用lh。弃去板中液体， 用PBST洗涤3次，加入新配制的TMB显色液100μL7孔，37°C显色5-10min，1M H2S〇4 50yL/孔终 止反应。用酶标测定仪测定〇D45〇nm值。阳性血清孔的0D45_i值2 1 ·0,阴性血清孔的OD45〇nm 值< 0.2，P/N>2.0时的抗原、血清最大稀释度为最佳工作浓度。
[0075]同时建立细胞I-ELISA方法作为辅助检测方法：
[0076] 1)无菌采集鹅静脉血，加入适量抗凝剂后，制备抗凝血，以1:1的比例与PBS混合；
[0077] 2)将上述混合液慢加入到等体积的淋巴细胞分离液界面上，2000rpm，离心15min。 吸取界面淋巴细胞，用PBS洗涤3次，2000rpm，离心5min;
[0078] 3)按Ludwig suter等改良方法，进行细胞ELISA，加入冰冷的0.1%戊二醛悬起细 胞，在4°C处理30min，PBS洗涤两次，将细胞悬浮于1%834/0.1111〇1/1甘氨酸1^3中，室温作用 60min，PBS洗涤两次，用PBS将细胞重悬，调整细胞浓度为1 X 10 7/mL，-20 °C保存。
[0079] 4)通过棋盘滴定的方法确定抗原和抗体的工作浓度，并确定ELISA的反应程序。
[0080] 2.2饲养层细胞的制备
[0081] 在融合前一天，将未进行免疫的BALB/c小鼠眼球采血，分离血清作为阴性血清，颈 椎脱臼处死，75%酒精消毒5min后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的解剖板上，用灭 菌剪刀剪开皮肤，同时用镊子钝性剥离使腹膜充分暴露。用l〇ml-次性注射器吸取含20% 胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，全部注入后，再用注射器抽出腹腔内的培养液， 加入到准备好的HAT培养液中，调整细胞浓度在2 X105个/mL，将细胞悬液混匀后加入到96 孔细胞培养板中，1 〇〇μL7孔，置于37 °C 5 % C02培养箱中培养。
[0082] 2.3骨髓瘤细胞的准备
[0083]融合前2天对于生长状态良好的骨髓瘤细胞扩大培养，融合当天，将处于生长旺盛 期的细胞收集至50ml离心管中，1000r/min离心15min，弃去上清，用不完全1640培养液洗涤 一次后，将细胞悬浮，计数，用于融合。
[0084] 2.4脾淋巴细胞的制备
[0085] 加强免疫后3天的BALB/c小鼠，眼球采血，颈椎脱臼处死，浸入75%酒精中消毒 5min，放入超净工作台中的解剖台上。用灭菌剪刀剪开小鼠皮