脏器指数;肝脏冰冻切片，在荧光显微镜 下观察移植的GFP+细胞在小鼠肝脏内的定植分布情况;肝脏组织石蜡包埋切片，HE染色、 Masson染色检测肝脏组织的病理改变。
[0034] CC14诱导的慢性肝损伤小鼠经尾静脉注射Ad-HUCMSCs、Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液 7d、14d后，取肝脏组织做冰冻切片，荧光显微镜下观察移植的GFP+细胞的分布，见附图4，A: Ad-HUCMSCs注射7 d;B:Ad-HUCMSCs注射 14 d;C:Ad-26b-HUCMSCs注射7 d;D:Ad-26b-HUCMSCs注射14 d。统计细胞数量，见附图5,与Ad-HUCMSCs组比较，# P<0.01。结果显示， 移植后7 d、14 d，在损伤的肝组织中高表达miR-26b的HUCMSCs数量均显著高于对照细胞， 表明miR-26b能够促进HUCMSCs归巢并定植于慢性损伤的肝组织中。
[0035] 附图6为肝脏石蜡切片Masson染色图，A: Ad-HUCMSCs组；B: Ad-26b-HUCMSCs组；结 果显示，慢性肝损伤(肝纤维化)小鼠模型移植高表达miR_26b的HUCMSCs 7 d、14 d后，纤维 组织的厚度和范围比移植对照细胞的各组显著降低，表明高表达miR-26b的HUCMSCs能够显 著减轻慢性损伤肝组织的纤维化程度。 以上结果显示，与对照组相比，高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植显著降 低了肝脏中的纤维组织间隔的宽度，说明高表达miR-26b的间充质干细胞移植对慢性肝损 伤的纤维化具有显著的修复能力。
[0036] 表2为慢性肝损伤小鼠尾静脉注射上述HUCMSCs细胞悬液7 d、14 d后肝功能及肝 脏指数，检测结果显示，带有miR-26b的干细胞移植后慢性肝损伤模型小鼠的肝功能指标谷 丙转氨酶、谷草转氨酶均有好转，治疗14 d较治疗7 d组好转更为明显;各移植治疗组小鼠 的体重略高于模型对照组。
[0037] 表2慢性肝损伤小鼠尾静脉注射HUCMSCs细胞悬液7 d、14 d后转氨酶及肝脏指数
实施例三高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植到急性肝损伤小鼠模型 1.急性肝损伤实验动物模型的准备 急性损伤动物模型按实施例一所述方法制备。
[0038] 2.移植细胞的准备 将50 nM miR-26b模拟物与5 μL转染试剂Lipofectamine 2000分别用250 μL L-DMEM 稀释，室温静置10 min后将二者混合，室温静置30 min，得到转染混合液;将培养至第8代的 HUCMSCs，培养汇合度达80%~90%，弃培养基，PBS清洗2遍，加入转染混合液和500 μ 1 L-DMEM;然后于37°C培养箱中孵育6 h，接着将转染混合液更换为完全培养基，继续培养48 h， 得到高表达miR-26b的细胞（26b-HUCMSCs)，可用于细胞移植。移植前按实施例一所述步骤 制成2X 106/ml的26b-HUCMSCs移植细胞悬液。
[0039]为了进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效 果，26b-HUCMSCs细胞于移植前换用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF)的培养基培养24 h，然后按实施例一所述步骤制成2 X 106/ml 的 bFGF 处理的 26b-HUCMSCs。
[0040] 3.细胞移植 尾静脉一次性给予26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的26b-HUCMSCs细胞悬液，剂量为 1.0 X 106/ kg。模型对照组尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。正常对照组动物尾静脉一 次性给予等剂量生理盐水。在移植细胞后7 d、14 d分别采血检测肝功能指标、脏器指数;肝 脏组织石蜡包埋切片，HE染色、Masson染色检测肝脏组织的病理改变。结果显示，与模型对 照组相比，高表达miR-26b的HUCMSCs移植后小鼠的肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶均 有好转，治疗14 d较治疗7 d组好转更为明显。
【主权项】
1. 一种肝损伤靶向间充质干细胞，其特征在于:所述肝损伤靶向间充质干细胞由间充 质干细胞转染或感染核酸制备得到;所述核酸为miR-26b。2. 根据权利要求1所述肝损伤靶向间充质干细胞，其特征在于:所述肝损伤靶向间充质 干细胞由间充质干细胞转染或感染核酸后，再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到。3. 根据权利要求1所述肝损伤靶向间充质干细胞，其特征在于:所述间充质干细胞来源 于骨髓、脂肪组织、牙髓、脐带、脐带血、羊水或者胎盘。4. 权利要求1所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于:通过转染试剂将 miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞;或者通过病毒载体将miR-26b转 入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞。5. 根据权利要求4所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于:所述转染试 剂为脂质体转染试剂;所述病毒为腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒或者慢病毒。6. 根据权利要求4所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于:通过转染试 剂将miR-26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将miR-26b模拟物 与转染试剂分别用L-DMEM稀释后混合，室温静置得到转染混合液;然后将培养至第4~8代、 汇合度达80%~90%的间充质干细胞经PBS洗涤，再加入转染混合液;然后于37 °C培养箱中孵 育5~6 h，接着把转染混合液更换为完全培养基，继续培养36~48 h即可得到肝损伤靶向 间充质干细胞； 通过病毒载体将miR_26b转入间充质干细胞得到肝损伤靶向间充质干细胞的步骤为将 培养至第4~8代、汇合度达80%~90%的间充质干细胞经PBS洗涤，然后加入表达miR-26b的 病毒上清液，37 °C感染85~95 min后，将病毒上清夜更换为完全培养基继续培养24~48 h 即可得到肝损伤靶向间充质干细胞。7. 根据权利要求4所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于:通过转染试 剂将miR-26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到肝损伤靶 向间充质干细胞;或者通过病毒载体将miR_26b转入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维 细胞生长因子处理得到肝损伤靶向间充质干细胞。8. 根据权利要求7所述肝损伤靶向间充质干细胞的制备方法，其特征在于:将转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，处理0.5~24 h得到肝 损伤靶向间充质干细胞;所述带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基中，碱性成纤维细胞 生长因子的浓度为5~20 ng/mL。9. 权利要求1~3所述任意一种肝损伤靶向间充质干细胞在制备治疗肝损伤的靶向药 物中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述肝损伤为病毒感染、寄生虫感染、乙 醇毒害、药物毒害、化学毒害或者免疫功能紊乱引起的肝损伤。
【专利摘要】本发明公开了一种肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用，由间充质干细胞转染或感染核酸制备得到，其高表达miR-26b，具体制备为将人间充质干细胞转染miR-26b？mimic或感染表达miR-26b的病毒制备得到；为了进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效果，可以利用碱性成纤维细胞生长因子处理间充质干细胞。本发明的肝损伤靶向间充质干细胞对肝损伤有高效的靶向性，有助于减轻肝纤维化、改善肝功能，稳定性高，便于保存和运输，使用安全，可为肝病患者带来福音。
【IPC分类】C12N15/86, A61K35/28, A61P1/16, C12N5/10, C12N15/88
【公开号】CN105647872
【申请号】
【发明人】贺丽虹, 张焕相, 许键炜
【申请人】苏州大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月4日