和XhoI双酶切鉴定，鉴定 正确的重组穿梭载体命名为pAdTrack-26b。随后将重组穿梭载体(pAdTrack-26b)与腺病毒 骨架载体pAdEasy-Ι在BJ5183感受态细胞中的同源重组，从而将目的基因连接到腺病毒表 达载体上。先将腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι转化至DNA重组活跃的BJ5183菌株中，在Amp+抗 性下培养及摇培重组菌株，制作感受态细胞。将重组穿梭载体pAdTrack-26b用Pme I限制性 内切酶线性化以暴露其同源重组位点，将酶切产物转化含pAdEasy-Ι载体的BJ5183感受态 细胞，在Kan+抗性的LB平板上培养，挑取单克隆，摇培、提质粒、琼脂糖凝胶电泳检测提取的 质粒，电泳条带的带型、大小与pAdEasy-Ι类似和相近的可能为重组正确的阳性克隆，进一 步将这些质粒用Pac I单酶切鉴定，鉴定完全正确即为表达miR-26b的重组腺病毒，命名为 pAdEasy-26b，将质粒、菌液分别在-80 °C保种。
[0023]将上述构建的重组腺病毒骨架质粒pAdEasy-26b，用Pac I单酶切，取少量电泳检 测，完全酶切的产物以Lipofectamine 2000按试剂说明书步骤转染70 %汇合的293A细胞中 包装。第一轮包装经7~10 d收获细胞，反复冻融三次以释放细胞中的病毒，4°C、5000 rpm离 心5 min，收集上清。将长至70%汇合的293A细胞吸尽培养液，PBS洗2遍，加入上述收集的病 毒上清夜进行第一轮感染，待50%以上的细胞变圆脱落后，收获细胞，反复冻融三次后收集 病毒上清液，按上述步骤进行下一轮感染。如此经3~5轮感染后可得到高滴度病毒液，接下 来可感染放大培养的293A细胞以扩增病毒，产生更多更高滴度的表达miR-26b的重组腺病 毒，命名为Ad_26b。稀释法或qPCR法检测病毒滴度，达到107 pfu/ml即可用于感染宿主细 胞，使宿主细胞高表达miR_26b。
[0024] 4.绿色荧光蛋白（GFP)标记的高表达miR-26b的HUCMSCs细胞 选择培养至第4代的HUCMSCs，培养汇合度达80%~90%，弃培养基，PBS清洗2遍，加入含约 20 μL Ad-26b病毒液(视病毒滴度而定）的L-DMEM，37°C、饱和湿度5%、C02培养箱感染1.5~2 h，去除病毒液，加入完全培养基，继续培养24~48 h，荧光显微镜下观察，GFP阳性细胞达70% ~80%以上且细胞状态良好可用于细胞移植。以感染空病毒Ad的HUCMSCs作为对照细胞。 [0025]图1为上述高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞及miR-26b的表达定量图； 分离培养的人脐带来源间充质干细胞HUCMSCs，多次传代后，经台盼蓝染色测定，各代次细 胞活率均在95%以上;流式细胞仪检测结果显示，培养至第3代以后的细胞表达⑶90+、⑶44 +、〇0105+、0)73+，而勵1'-!11^15〇8阴性，符合!11^1^〇8的生物学特征。感染表达111丨1?-2613的重 组腺病毒（Ad-26b) 48 h后，miR-26b的表达量比感染空病毒的对照组显著上调。
[0026] 5.移植用细胞悬液的准备 (1) HUCMSCs感染高表达miR-26b的病毒载体（Ad-26b)及对照病毒（Ad)，继续培养 48 h后，得到高表达miR-26b的细胞(Ad-26b -HUCMSCs)及对照细胞(Ad-HUCMSCs)，可用于 细胞移植。移植前，细胞弃原培养基，PBS洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液消化，在显微镜 下观察细胞短缩变形后，加入完全培养基终止消化，吹打细胞制成单细胞悬液，1000 r/ min，离心5 min，去除上清液，再用生理盐水重悬、洗涤、离心2次，将培养液成分去除。加入 生理盐水重悬细胞，细胞计数，调整细胞密度为2X106/ml，标记为Adieb-HUCMSCs^d-HUCMSCs 细胞悬液， 4-10°C储存备用， 存储有效期为12 h。
[0027] 为了进一步提高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效 果，Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs细胞于移植前换用含10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF)的培养基培养20 h，然后按（1)所述步骤消 化、洗涤、生理盐水重悬，制成2 X 106/ml的bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs细胞悬 液。
[0028] 6.细胞移植 急性损伤动物模型随机分为细胞治疗组(40只）和模型对照组（10只）。细胞移植治疗组 分别尾静脉一次性给予Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、 Ad-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-HUCMSCs细胞悬液，剂量为1.0X 106/ kg。模型对照组 尾静脉给予等剂量生理盐水。正常对照组动物尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。
[0029] 在移植细胞后的第7 d和14 d分别随机选择5只小鼠，乙醚麻醉后摘眼球取血，检 测△1^^51^1^、了811^、凝血功能等肝功能指标;取血后处死，取肝脏称重，测算脏器指数;之 后以4%多聚甲醛固定，取部分肝脏冰冻切片，在荧光显微镜下观察切片中绿色荧光阳性细 胞在小鼠肝脏内定植分布情况，见附图2，其中A:Ad-HUCMSCs注射7 d; B:Ad-HUCMSCs注射14 d; C: Ad-26b-HUCMSCs注射7 d; D: Ad-26b-HUCMSCs注射14 d;统计细胞数量，见附图 3，与Ad-HUCMSCs组比较，* P<0.05，*# P<0.001。结果显示，移植后7 d、14 d，在损伤的肝组织中 高表达miR-26b的HUCMSCs数量均显著高于对照细胞，表明miR-26b能够促进HUCMSCs归巢并 定植于损伤的肝组织中。
[0030] 剩余部分肝组织石蜡包埋切片，行HE染色及Masson染色以及白蛋白免疫组织化学 检测肝脏病理改变。表1为上述高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射 移植到CC14诱导的急性肝损伤小鼠中7d、14d后肝功能转氨酶指标与肝脏指数。结果显示， 带有miR-26b的间充质干细胞移植后谷丙转氨酶、谷草转氨酶均有好转；治疗14 d较治疗7 d的各组好转更为明显。
[0031] 表1急性肝损伤小鼠尾静脉注射HUCMSCs细胞悬液7 d、14 d后转氨酶及肝脏指数
实施例二高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植到慢性肝损伤小鼠模型 1.慢性肝损伤实验动物模型的准备 昆明种小鼠，40只，雄性。随机数字表法分为正常对照组（10只）和模型组(50只）。模型 组均按照3 ml/kg剂量、每周2次（固定时间点于每周一和周五下午14:00)皮下注射CC14与 橄榄油等体积(1:1)混合液，正常对照组皮下注射等剂量橄榄油，方法同实施例一。连续注 射6周后，改为每周注射1次。直到第10周。建模第10周，最后一次造模后24 h，进行移植实 验。
[0032] 2.移植细胞的准备 Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液的制备同实施例一； 其中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的浓度为10 ng/ml，处理时间为24 h。
[0033] 3.细胞移植 慢性损伤动物模型随机分为细胞治疗组(40只）和模型对照组（10只）。细胞移植治疗组 分别尾静脉一次性给予Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-26b-HUCMSCs细胞悬液、 Ad-HUCMSCs细胞悬液、bFGF处理的Ad-HUCMSCs细胞悬液，剂量为1.0X 106/ kg。模型对照组 尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。正常对照组动物尾静脉一次性给予等剂量生理盐水。 在移植细胞后7 d、14 d分别采血检测肝功能指标、