入间充质干细胞，然后再经过碱性成纤维细胞生长因子处理得到肝损伤靶向间充质 干细胞。比如将转入miR-26b的间充质干细胞置入带有碱性成纤维细胞生长因子的培养基 中，处理0.5~24 h得到肝损伤靶向间充质干细胞;所述带有碱性成纤维细胞生长因子的培 养基中，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5~20 ng/mL;使用bFGF处理MSCs，可进一步提 高MSCs靶向肝损伤部位的效率，改善肝功能和组织结构恢复的效果。
[0011] MicroRNAs (miRNAs)是一种小的、类似于siRNA的核酸分子，由基因组编码，在不 同的组织细胞类型中miRNAs分子的表达谱和表达量有很大差异，因此不同miRNA的功能不 同，即便是同一种miRNA在不同的组织细胞类型中所发挥的功能可能也有很大差异。不同修 饰状态的间充质干细胞与体内细胞因子的亲和力不同，使得趋化、定植数量不同，定植于肝 脏的间充质干细胞数量不同，分化、转分化效率及旁分泌等作用强弱就不同，其发挥的生物 学效应也不同，对疾病的改善亦有所差异。
[0012] 本发明公开的肝损伤靶向间充质干细胞可以高效定植于肝损伤部位，避免血流冲 刷或者自然脱落，增加归巢细胞量，并且低表达smad蛋白，避免移植MSCs存在的促纤维化风 险，从而不仅有效发挥间充质干细胞修复肝损伤部位的组织结构与功能的作用，更降低了 现有MSCs存在的促纤维化风险，真正实现移植间充质干细胞的肝损伤修复。因此本发明还 公开了上述肝损伤靶向间充质干细胞在制备治疗肝损伤的靶向药物中的应用；引起肝损伤 的途径主要为病毒感染、寄生虫感染、乙醇毒害、药物毒害、化学毒害或者免疫功能紊乱等， 动物体内肝损伤主要表现为病灶部位细胞凋落、组织坏死等，对于肝损伤的修复主要是通 过各种方法稳定保护受损的肝细胞，促进病变细胞恢复，刺激正常肝细胞DNA合成，促进肝 细胞再生，减轻肝纤维化，以重建正常的肝组织结构，修复肝功能。间充质干细胞药物一般 为注射型，通过血管输入，随着血液循环，到达病灶部位。与体外相比，动物体内的血液环境 复杂，存在各种物质与因子，而且不同部位的微环境差别大，对间充质干细胞的输送有明显 影响;并且肝损伤部位为活性组织，具有自身新陈代谢，还受血流、免疫系统的影响，不利于 外来细胞的定植和存活。这也是现有技术中，体外效果不错(增殖、迀移能力强)的间充质干 细胞在体内肝损伤部位定植能力差、归巢细胞数量少的主要原因。
[0013] 本发明公开的间充质干细胞能显著提高归巢于肝脏损伤部位的移植细胞数量，提 高细胞定植能力，为有效进行肝损伤修复提供良好的基础;本发明公开的间充质干细胞可 以减轻肝纤维化程度，改善肝功能指标，提高免疫功能，降低炎性细胞因子分泌的能力，减 轻炎症反应，抑制肝星状细胞活化、阻止细胞外基质的生成，激活卵原细胞，促进肝细胞再 生;因此，基于本发明间充质干细胞的靶向药物可以有效修复肝损伤。
[0014] 本发明中microRNA_26b (miR_26b)调节MSCs的定向富集，在MSCs中表达miR-26b，显著促进了MSCs趋向肝损伤部位的能力；尤其是5~20 ng/mL(优选10 ng/ml)的bFGF 处理后显著促进了表达miR-26b的MSCs趋向肝损伤部位的能力，修复损伤部位的组织结构 和功能;并且表达miR_26b的MSCs下调其表达smad蛋白，降低移植MSCs的促纤维化风险，从 而有利于肝损伤的修复。根据本发明的实施例，构建了表达miR-26b的重组腺病毒（Ad-26b)，MSCs感染Ad-26b 48 h后，移植到急、慢性肝损伤模型小鼠体内，移植前一天细胞用含 bFGF的培养基处理24 h，移植7 d、14 d后收集小鼠血液分析肝功能，处死小鼠取肝脏组织 做冷冻切片和石蜡切片，进行免疫荧光染色、HE染色或Masson染色，观察移植细胞在肝组织 中的数量及分布，分析肝组织炎症、纤维化等病理修复情况；结果显示，高表达miR_26b的 MSCs移植对肝损伤具有良好的治疗和修复效果，为临床应用提供理论和实验依据。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例一制备的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞的表达图； 图2为实施例一的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到 CC14诱导的急性肝损伤小鼠中7 d、14 d后肝脏冷冻切片图； 图3为实施例一间充质干细胞肝损伤部位的数量图； 图4为实施例二的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到 CC14诱导的慢性肝损伤小鼠中7 d、14 d后肝脏冷冻切片图； 图5为实施例二间充质干细胞肝损伤部位的数量图； 图6为实施例二的高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞通过尾静脉注射移植到 CC14诱导的慢性肝损伤小鼠中7 d、14 d后肝脏石蜡切片Masson染色图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述。
[0017] 实施例一高表达miR-26b的人脐带来源间充质干细胞移植到急性肝损伤小鼠模 型 1.急性肝损伤实验动物模型的准备 昆明种小鼠，40只，雄性。随机数字表法分为正常对照组（10只）和模型组(50只）。模型 组均按照5 ml/kg剂量一次性皮下注射CC14与橄榄油等体积（1:1)混合液，正常对照组皮 下注射等剂量橄榄油。建模24 h后，进行移植实验。
[0018] 2. MSCs的分离、培养及鉴定 采用人脐带来源的间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUCMSCs)。采集新生儿脐带约10 cm，去除脐带外膜层和脐带内动静脉，保留华尔通胶，机械 法消化，剪碎至约1 mmXl mmXl mm，平铺接种于75 cm2培养瓶，10% FBS+L-DMEM，37°C，饱 和湿度下，5% C02培养箱培养，倒置相差显微镜下逐日观察，3~5 d后半量换液，以后每3 d 用含10% FBS的L-DMEM全量换液，待细胞融合至50%后去除组织块，继续培养，待细胞融合至 80%~90%后传代。取1~5代传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4%台盼蓝作为染色剂，用细胞计 数板计数活细胞和死细胞，共3次，取3次平均值，计算细胞活率:活细胞率(％)=(未染色细胞 数/观察细胞总数）X 100%。活率在90%以上。
[0019] 不同生长周期的HUCMSCs其形态学有其不同特点，利用倒置相差显微镜和荧光显 微镜观察细胞的生长情况及形态学特点。
[0020] 贴壁细胞常规0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的L-DMEM液终止，加入含1% FBS的roS液洗涤后，以FITC标记的⑶105 (SH2)、⑶44抗体及其相应同型对照标记细胞，流 式细胞仪检测。
[0021]细胞表面⑶分子检测：收集培养第1~8代细胞，分成每EP管（1.5 ml) IX 105细 胞，洗涤后重悬于20 μL的PBS，分别加入小鼠抗人直标PE或FITC单抗CD90、CD44、CD105、 ⑶73,设立阴性对照。流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析结果。
[0022] 3. miR-26b重组腺病毒表达载体(Ad-26b)的构建 利用带有Bgin和Xhol酶切位点的rn〇-miR-26b 引物（SEQIDNo·l:5'-CATAGATCTCCCCACATATAACACTG-3 '； SEQ ID No·2: 5 '-GGACTCGAGATAGTGAAGGAGGAAGGG-3'），以大鼠间充质干细胞基因组DNA为模版PCR得到目的基因片段，回收目的基因片段，与 pMD-19-T载体连接后转化DH5a感受态细胞，挑取单克隆过夜摇培扩增，提取质粒，Bgl Π 和 Xhol双酶切鉴定，鉴定正确的阳性克隆送上海生工测序鉴定。测序鉴定完全正确的目的基 因片段与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV利用预设的Bgl Π 和Xhol进行双酶切定向克隆，产 物转化ToplO感受态细胞，单克隆过夜摇培扩增，提取质粒，Bgl Π