过三次冷冻抽排过程达到除氧的目的，在惰性气体的保护下加入配 体PMDETA(N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚乙基三胺，77.8mg，450ymol)和L-异亮氨酸甲基丙烯 酰胺(430mg，2.16mmol)，随后用橡胶塞密封，经过搅拌CuBr和配体完全络合后，将反应管加 入65 °C油浴中开始反应。经过特定的时间可得到相应链长的聚合物:如30分钟可得15个链 长的聚合物。反应结束后，通过旋转蒸发除去溶剂，将剩余物透析三天，每5小时换一次去离 子水，最后经过冷冻干燥得到最终产物聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺，简称P1，其核磁谱图见 附图4。
[0061] 实验例1聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的光学特性
[0062] 将1.2mg聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺(P1)溶解在8mL纯水中，制成浓度为1.25 X 10-5mol/L的水溶液，分别将其稀释成浓度为6 · 25 X 10-6mol/L，4 · 16 X 10-6mol/L，2 · 76 X 10- 6mol/L和1.84Xl(T6m〇l/L的水溶液，并分别测试它们的紫外吸收和荧光发射谱图，见附图 5〇
[0063] 为了观察蛋白质对P1荧光性质的影响，取浓度为5.00X10-5m〇l/I^Hist 〇ne(HS) 水溶液20yL滴加到浓度为1.84X 10-6mol/L的P1水溶液中，即在P1水溶液中加入一份HS，测 试并记录其荧光光谱，并按照相同的方法陆续加入总计8份HS，得到的荧光光谱比较见附图 6。实验例2外源蛋白分子运载进入活细胞
[0064] 将合成的氨基星形聚合物载体分子与外源碱性蛋白分子形成载体/蛋白分子复合 物，与活体培养细胞一起孵育，考察了蛋白分子和载体络合的比例，即载体分子所带阴离子 的电荷量与蛋白分子所带阳离子的电荷量比(N/P)对细胞转染的影响。如附图7所示，通过 研究以不同N/P比（4:1，2 :1，1:1;2:1，4:1)形成的载体分子和蛋白分子复合物转染细胞的 结果发现，载体分子在所有N/P比条件下均显示良好的运载能力。以4:1的N/P合成载体/蛋 白分子复合物孵育细胞时，〇.5h时细胞内可检测出外源蛋白分子信号，表明载体分子能够 快速高效地携带外源蛋白分子进入活细胞。
[0065] 实验例3与杀虫蛋白分子联合作用防治昆虫
[0066]载体分子结合Bt毒蛋白分子杀灭对Bt具有抗性的昆虫
[0067] 在25°C条件下，将4yg载体分子和lyg杀虫Bt蛋白分子混合形成载体/Bt毒蛋白分 子复合物，半小时后，加入2mg昆虫饲料中，与饲料混匀后单独饲喂刚孵化出的一龄幼虫。每 隔24h观察拍照，并量其体长和体重。在此设置2个对照组，分别是:单独Bt毒蛋白分子，单独 载体分子。72h后，载体分子/Bt毒蛋白分子饲喂的幼虫中毒死亡。12d后，观察存活下来的幼 虫，我们还发现载体分子/Bt毒蛋白分子复合物饲喂的幼虫发育迟缓，体长和体重相比其余 对照均有下降。以上结果见附图8。因此，载体分子结合Bt毒蛋白分子进入幼虫的肠细胞内， 充分发挥Bt毒蛋白分子的作用，抑制昆虫正常的生长发育，使昆虫中毒致死。
[0068] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种巧光星形聚合物，其特征在于，其结构如式(IV)所示：其中，R为氨原子或者含碳数为1~9的烷基，n=l~100，k=l~4，m=l~3。2. 根据权利要求1所述的巧光星形聚合物，其特征在于，n = 5~30, k=l~2，m = 2~3, R 为碳数在2~4之间的烷基链。3. 根据权利要求1或2所述的巧光星形聚合物，其特征在于，所述的巧光星形聚合物为 聚心异亮氨酸甲基丙締酷胺，化学结构式如式(V)所示：其中，n=15。4. 权利要求1所述巧光星形聚合物的制备方法，其特征在于，单体化合物2在引发剂化 合物3的作用下，采用ATRP活性聚合得到巧光星形聚合物； 单体化合物2的结构如式(II)所示：化合物3的结构如式(III)所示：其中，R为氨原子或者含碳数为1~9的烷基，k=l~4，m=l~3。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，化合物2相对化合物3的用量为10~ 500倍，在60~70°C的条件下进行反应； 优选地，将化合物3溶于有机溶剂中，使得化合物3的浓度在2~5g/L范围内，加入与化 合物3等物质的量的Cu化后，进行3~4次冷冻-抽排循环;之后在氮气保护下，加入5~15倍 于化合物3物质的量的配体PMDETA及10~500倍于化合物3物质的量的单体化合物2;再次冷 冻抽排后，揽拌10~15分钟，使化化与配体完全络合，在60~70°C下反应30~120分钟;反应 结束后，除去溶剂，透析，冷冻干燥。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为下酬和甲醇的混合 物，下酬和甲醇的体积比为2:1。7. 根据权利要求4~6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述单体化合物2的制备方 法为:将化合物1溶解在氨氧化钢水溶液中，使得溶液的pH值在IOW上，随后在(TC附近，逐 滴加入甲基丙締酷氯，并补充相应的氨氧化钢溶液W维持抑值在9~11之间；滴加完毕后， 在室溫下揽拌1~3个小时，之后用稀盐酸对溶液进行酸化，使得抑值降至1~3之间；用乙酸 乙醋萃取，用旋转蒸发仪除去大部分溶剂，通过热饱和溶液法重结晶，得到化合物2; 化合物1的结构如式(I)所示：其中，R为氨原子或者含碳数为I~9的烷基。8. 权利要求1~3任一项所述的巧光星形聚合物作为蛋白分子载体的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将巧光星形聚合物作为蛋白分子载体，携 带外源毒蛋白分子进入细胞内或昆虫体内； 作为优选，所述巧光星形聚合物与外源蛋白分子混合形成复合体，然后与细胞共解育， 通过细胞内吞作用使携带有外源蛋白分子的巧光星形聚合物载体进入细胞内，或通过注射 或喂饲昆虫的方法，使携带有外源蛋白分子的巧光星形聚合物载体进入昆虫体内。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白分子为正电荷的组蛋白或 负电荷的Bt毒蛋白。
【专利摘要】本发明涉及化合物制备及蛋白分子载体，具体公开了一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用。本发明荧光星形聚合物以苝类衍生物及其类似物作为荧光核，采用“发散法”制备出了不同代数、携带氨基酸特征基团的荧光星形聚合物。该类荧光星形聚合物分子，因其外围携带特殊的氨基酸基团，易被活体培养细胞识别并吞噬。并且通过非共价键，能够分别与带有负电荷或正电荷的蛋白分子结合，各自形成稳定的复合体。本发明荧光星形聚合物可以作为载体，可以保护并运载外源蛋白分子成功进入活体培养细胞，通过食物饲喂的方法，杀虫毒性蛋白分子能够通过聚合物的运载功能高效地进入活体昆虫体内细胞，方便其发挥毒力作用，导致昆虫发育迟缓和中毒致死。
【IPC分类】A01K67/033, A01P7/04, A01N25/10, C08F120/58
【公开号】CN105646752
【申请号】
【发明人】沈杰, 郑洋, 尹梅贞, 尤树森, 冀辰东
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年10月29日