[0032] 本发明还进一步提供了所述荧光星形聚合物作为蛋白分子载体的应用。
[0033] 所述应用具体为，将荧光星形聚合物与外源蛋白分子混合形成复合体，然后与细 胞共孵育，通过细胞内吞作用使携带有外源蛋白分子的荧光星形聚合物载体进入细胞内， 或通过注射或喂饲昆虫的方法，使携带有外源蛋白分子的荧光星形聚合物载体进入昆虫体 内。
[0034] 可选的，将所述荧光星形聚合物应用于活体细胞：
[0035] 把此类荧光星形聚合物以一定的浓度加入到细胞培养液中，培养活体细胞一段时 间后，该类化合物迅速通过细胞内吞作用进入细胞内，通过荧光显微镜拍照分析，清晰观察 该类化合物分子在细胞内的分布状况。将该类化合物外源蛋白分子在试管内混合形成复合 体，然后同上述方法与细胞一起孵育一段时间后，该类化合物发挥蛋白分子载体功能，携带 外源蛋白分子快速进入细胞，以便外源功能性蛋白分子在细胞内发挥功能。
[0036] 可选的，将所述荧光星形聚合物应用于活体昆虫：
[0037] 把此类荧光星形聚合物与功能性外源杀虫Bt毒蛋白分子混合形成复合体，以一定 的浓度加入到昆虫饲料中，供昆虫取食一段时间后，该类化合物发挥蛋白分子载体功能，在 昆虫肠道内保护外源毒蛋白分子迅速穿透围食膜屏障，进入肠细胞内，大幅增加了进入靶 标细胞的蛋白分子数量，以极少的用量，实现该蛋白分子对昆虫的毒杀作用，使得昆虫发育 迟缓和中毒死亡。该过程在即使在缺乏该毒蛋白分子受体的抗性昆虫中仍然适用，打破了 昆虫对Bt毒蛋白分子的抗性，扩大了 Bt毒蛋白分子的杀虫谱。
[0038] 作为一种新型的可被荧光追踪的蛋白分子载体，此类聚合物在药物蛋白分子运载 的生物医学领域及害虫防治领域具有很好的应用价值。
[0039] 本发明在提供了荧光星形聚合物的基础上，进一步提供一种毒杀昆虫的方法，其 是以前述荧光星形聚合物作为蛋白分子载体，携带外源毒蛋白分子进入细胞内或昆虫体 内，从而毒杀昆虫。
[0040] 可选的，该荧光星形聚合物载体可通过注射或喂饲昆虫的方式，进入昆虫体内，从 而毒杀昆虫。
[0041] 作为优选，所述外源蛋白分子的代表为正电荷的组蛋白或负电荷的Bt毒蛋白，该 类蛋白与本发明提供的荧光星形聚合物能够更好的结合，被高效地运载进入细胞。
[0042]本发明的有益效果在于：
[0043] 本发明提供了一类新型高效蛋白载体，可运送杀虫毒蛋白分子，打破外源毒蛋白 分子的进入昆虫肠细胞的屏障，大幅提高毒蛋白特别是Bt毒蛋白的杀虫效率，扩大Bt毒蛋 白的杀虫谱。
[0044] 本发明通过分子设计合成了以有机荧光发色团为核心并携带有氨基酸基团的功 能性荧光星形聚合物。该类聚合物具有良好的光、热、化学稳定性、结构可设计性、优异的 生物相容性等特性。
[0045] 本发明步骤简单易行，可迅速制备结构可设计的星形聚合物:一方面可通过改变 引发剂的代数，控制聚合物的臂数；另一方面可通过调整加料比例或反应时间调控聚合物 链长。
[0046] 本发明制备得到的荧光星形聚合物的结构特征中有大量氨基酸残基，其中的羧基 和烷基为蛋白质的吸附提供了条件，使得无论是负电性的还是正电性的蛋白质都可以通过 静电吸附或氢键与范德华力与聚合物形成稳定结合。更重要的是，吸附了蛋白质后所形成 的复合物可以顺利地进入细胞，这与氨基酸残基有很大的联系。具体的说，本发明提供的荧 光星形聚合物分子外围携有氨基酸基团，能够进入活细胞，并且能够通过离子键与带正电 荷的蛋白分子如组蛋白分子结合，形成一个稳定的复合物，可以作为蛋白分子载体，保护并 携带外源蛋白分子进入活细胞。该类载体分子也能通过范德华力或氢键作用，结合带负电 的Bt毒蛋白分子，运载Bt蛋白分子进入昆虫肠细胞，引发致死过程，使昆虫生长发育迟缓和 中毒死亡。因此，该类载体作为一种新型的荧光高分子蛋白分子载体在生物医药领域和农 业昆虫防治领域具有很好的应用价值。
【附图说明】
[0047]图1为合成L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的路线图
[0048] 图2为4Br-PDI的合成路线图
[0049] 图3为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的合成路线图
[0050] 图4为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的核磁谱图
[0051] 图5为不同浓度聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺水溶液的紫外吸收和荧光光谱图 [0052]图6为聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺和组蛋白分子(HS)发生作用的紫外吸收和荧光 光谱图
[0053]图7为载体分子携带外源蛋白分子进入细胞。A' .载体携带外源蛋白分子进入细 胞的荧光成像图。B'.被携带进入细胞的蛋白分子荧光图。B".进入细胞的载体荧光图。D.不 同孵育时间载体分子所携带进入细胞的外源蛋白分子荧光强度。
[0054]图8为载体/Bt毒蛋白分子防治抗Bt昆虫。A.饲喂单独载体的昆虫幼虫。B.饲喂单 独毒蛋白分子的昆虫幼虫生长发育正常。C.饲喂载体/Bt毒蛋白分子复合体后幼虫生长发 育受阻。D.饲喂载体/Bt毒蛋白分子复合体后幼虫死亡。
【具体实施方式】
[0055] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0056] 实施例1
[0057]实施例1以星形聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺为例，用于说明本发明所述荧光星形 聚合物的制备方法。
[0058] (1)单体的合成：如附图1所示，将L-异亮氨酸（1 ·0g，7 · 5mmol)溶解在氢氧化钠水 溶液中（lmo 1 /L，7 · 5mL)并搅拌均匀。在0 °C下逐滴滴加甲基丙烯酰氯（1 · 17g，11 · 2mmo 1)，在 30分钟的滴加过程中用浓度为2mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH值，使其维持在10附近。回 到室温(25°C)开始反应时，pH值维持在7.5附近。1个小时之后，用盐酸水溶液(2mol/L)进行 酸化，然后用乙酸乙酯进行萃取(4X30mL)。有机相经过无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪 除去大部分溶剂，之后通过重结晶的方法得到产物最终得到产物1.4g，即L-异亮氨酸甲基 丙烯酰胺，产率90 %。
[0059] (2) 4Br-PDI的合成：如附图2所示，将四羟基茈酰亚胺(40H-roI，400mg，0.32mmo 1) 溶于40mL THF，转移至250mL三口烧瓶，通氮气15分钟，排除空气，将烧瓶加入冰浴中，直至 降温并保持在〇°C附近，先加入三乙胺（1.80mL，12.8mmol)，然后逐滴滴加2-溴异丁酰溴 (1.60mL，12.8mm 〇l)。搅拌10分钟之后，逐渐升温至室温开始反应。使用薄层色谱检测反应 程度，48小时候结束反应。用水洗的方法除去反应物中的盐类，得到粗产物。使用二氯甲烷 做淋洗剂，柱色谱分离得到纯产物，即四溴茈酰亚胺(4Br-PDI)450mg，产率76%。
[0060] (3)聚L-异亮氨酸甲基丙烯酰胺的合成：如附图3所示，将引发剂4Br-roi(10.0mg， 5.4μηιο 1)和催化剂CuBr (3. lmg，21.6μηιο 1)加入25mL反应管中，用2mL 2_丁酮和甲醇的混合 物(体积比2:1)溶解，经