一种荧光星形聚合物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及化合物制备及蛋白载体领域，具体地说，涉及一种荧光星形聚合物及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 由于目前大规模种植Bt转基因作物，没有科学规划地滥用Bt类化学农药，使得原 先的敏感型昆虫对Bt的抗性急剧增加，成为害虫防治领域的一大难题。通过科学的方法来 打破昆虫抗性变得尤为重要。目前常用的策略主要是通过科学的布局，在Bt转基因作物周 围种植非转基因作物以提供昆虫的"避难所"，或通过增加 Bt毒蛋白分子的多样性，避免昆 虫的抗性基因频率迅速扩大，从而延缓昆虫的Bt抗性。这些方法能够在一定程度上延缓昆 虫的抗性进化，但在应用过程中并不容易实施。种植者的素质、种植规模等实际问题，限制 了它们的应用范围。有研究表明，昆虫对毒蛋白分子的抗性一部分原因是昆虫基因突变后， 肠道细胞膜上的毒蛋白分子受体变异或表达量大幅减少，使得外源毒蛋白分子很难结合上 细胞膜受体，导致毒蛋白毒力下降，害虫产生抗药性。
[0003] 近几年高分子材料在蛋白分子载体系统中的发展十分迅速，其中蛋白分子载体体 系主要包括可降解聚合物微球、水凝胶、多壁碳纳米管、电荷反转型胶束等。而以荧光星形 聚合物作为蛋白分子载体的研究还未报道过。茈酰亚胺类化合物是一类光、热、化学稳定性 非常良好的荧光化合物，荧光量子效率非常高(接近于1)。凭借其优越的染色性能，一直被 广泛应用于有机光电器件、激光染料等光电领域。
[0004] 近年来，此类化合物开始应用于生物领域，如蛋白分子靶向标记和细胞特异性标 记等。然而水溶性差这一缺点，直接影响了其在此领域的应用。因此提高这类化合物的水 溶性并增强与蛋白分子的亲和性，将对研发新型蛋白分子载体具有非常重要的意义。氨基 酸是蛋白分子的基本组成单元，而聚合得到的聚氨基酸与蛋白分子拥有相似的功能基团， 根据"相似相容"原理，两者具有非常好的亲和性。因此通过水溶性的氨基酸基团对茈类化 合物外围进行修饰，既可提高其水溶性又可以增强对蛋白分子的亲和性。
[0005] 星形聚合物是树状聚合物中最简单的一种拓扑结构，具有设计方便，合成周期短 的特点。另外，星形聚合物还具有其它一些优点，如分子内部具有空腔结构、官能团密度高 等。这些优点使其在设计合成茈类聚氨基酸并应用于蛋白分子载体方面拥有巨大优势。因 而，发明一种简单、高效的方法用于制备氨基酸功能化的茈类荧光星形聚合物，研究这类荧 光星形聚合物作为蛋白分子载体在生物医药领域和昆虫防治领域的应用，将具有非常重要 的意义。
[0006][0007] 然而，上述技术方案中的荧光星形聚合物属于氨基类聚合物，作为阳离子型的聚 合物，氨基类聚合物可以利用与DNA之间的静电吸附作用，达到运载基因的目的，目前它们 只能作为负电性核酸物质如DNA和dsRNA的载体，而无法作为通用型蛋白分子载体。
【发明内容】
[0008] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种能够携带蛋白分子的 荧光星形聚合物及其制备方法与应用。
[0009] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种荧光星形聚合物，其结构如式（IV)所 示：
[0010]
[0011] 其中，R为氢原子或者含碳数为1~9的烷基，n = l~100，k = l~4，m=l~3。
[0012] 其中的波浪线代表某种起到连接作用的化学结构。
[0013] 作为优选，所述的焚光星形聚合物中，n = 5~30, k=l~2，m = 2~3, R为碳数在2~ 4之间的烷基链有更好的效果。其原因在于，当m=2-3时中间的荧光核由两个或三个萘环相 连形成共辄结构，即花和三萘嵌二苯。它们的焚光发射波长>600nm，高于生物背景焚光的波 长范围（400-550nm)，有利于其发挥生物成像的优势。当n = 5~30，k=l~2时，聚合物的重 复单元数较少，总数低于1200个，聚合物的体积相对较小，比表面积相对较大，有利于对蛋 白质的吸附，并且和蛋白质形成的复合物体积也相对较小，有利于实现细胞的吞噬。而当R 为碳数2~4之间的烷基时，既保证了聚合物的水溶性，又增加了与蛋白质之间的分子间作 用力。
[0014] 在本发明的一个具体实施例中，所述的荧光星形聚合物为聚L-异亮氨酸甲基丙烯 酰胺，化学结构式如式(V)所示：
[0015]
S
[0016] 其中，n = ]_5。
[0017] 上述聚合物具有共辄的多苯环结构，即茈，其荧光发射波长在620nm左右。聚合物 含有四个聚合物链，分子结构为发散的星形结构，且每个重复单元中都含有异亮氨酸的残 基，即羧基和烷基结构。
[0018] 本发明还提供了所述荧光星形聚合物的制备方法，其是以化合物2为单体，以化合 物3为引发剂，采用ATRP活性聚合得到荧光星形聚合物；
[0019] 单体化合物2的结构如式(II)所示：
[0020]
[0021]化合物3的结构如式(III)所示：
[0022:
[0023]其中，R为氢原子或者含碳数为1~9的烷基，k = l~4，m=l~3。
[0024]式（III)中的化合物具有共辄的多苯环结构，在波长为200-700nm的光照下可发出 波长为400_750nm的荧光，其外围有多个溴异丁基酯结构。这类化合物可作为ATRP引发剂， 引发式(II)中的单体化合物，式中R为氢原子或者含碳数为1~9的烷基。得到的聚合物保持 了荧光特性，且其外围聚合物链中含有大量氨基酸残基，整个聚合物呈发散的星形结构。 [0025]更为具体地，所述制备方法是:化合物2相对化合物3的用量为10~500倍，在60~ 70°C的条件下进行反应。在该条件下，所述反应能够在反应速率和分子量分布方面得到更 好的控制。
[0026] 作为优选，将化合物3溶于有机溶剂中，使得化合物3的浓度在2~5g/L范围内，加 入与化合物3等物质的量的CuBr后，进行3~4次冷冻-抽排循环;之后在氮气保护下，加入5 ~15倍于化合物3物质的量的配体PMDETA(N，N，N'，N，'N"-五甲基二亚乙基三胺)及10~500 倍于化合物3物质的量的单体化合物2;再次冷冻抽排后，搅拌10~15分钟，使CuBr与配体完 全络合，在60~70 °C下反应30-120分钟;反应结束后，除去溶剂，透析，冷冻干燥。
[0027] 作为优选，所述有机溶剂为丁酮和甲醇的混合物，丁酮和甲醇的体积比为2:1。本 申请用到的ATRP聚合属于溶液聚合，采用丁酮和甲醇的混合物可以实现油溶性的引发剂和 水溶性的单体溶解在同一体系中，从而有利于聚合反应的进行。
[0028] 进一步地，所述单体化合物2的制备方法为:将化合物1溶解在氢氧化钠水溶液中， 使得溶液的pH值在10以上，随后在0°C附近，逐滴加入甲基丙烯酰氯，并补充相应的氢氧化 钠溶液以维持pH值在9~11之间；滴加完毕后，在室温下搅拌1~3个小时，之后用稀盐酸对 溶液进行酸化，使得pH值降至1~3之间；用乙酸乙酯萃取，用旋转蒸发仪除去大部分溶剂， 通过热饱和溶液法重结晶，得到化合物2;
[0029] 化合物1的结构如式(I)所示：
[0030]
[0031] 其中，R为氢原子或者含碳数为1~9的烷基。