H3(SerlO)的表达情况。结果显示：突变组细胞 (JB6/FF)的p-Histone H3(Ser 10)水平较JB6/WT低，说明Src磷酸化Τ0ΡΚ后增强其活性。（见 图5A)
[0140] 5.2我们用EGF(20ng/ml)分别刺激Src+Λ、Src-Λ细胞15分钟后，同上检测p-Hi stone H3( Ser 10)的表达，结果显示:EGF刺激后Src+/+细胞内p-Hi stone H3( Ser 10)的水 平明显高于Src+细胞。（见图5B)
[0141] 6. Src使Τ0ΡΚ泛素化结合降低，增强了 Τ0ΡΚ的稳定性。
[0142] 6.1我们瞬时转染 pcDNA4-His-Src(His-Src)、pcDNA3-HA-T0PK(HA-T0PK)和 pCMV-Flag-ubiquitin(Flag-Ub)到293T细胞，用HA抗体免疫沉淀Τ0ΡΚ后检测Flag的表达情况。具 体步骤如下：
[0143] 6.1.1利用811^16卩6(^分别将卩1&8-1]13、骱-1'0?1(以及出8-5代、卩1&8-1]13和骱-1'0?1( 转入到293T细胞，48h后用1 % CHAPS收样。
[0144] 6.1.2用anti-HA(北京普瑞金公司，1:200)免疫沉淀裂解液中的Τ0ΡΚ蛋白，免疫印 迹法检测Flag( sigma公司，1:1000)的表达。结果表明：Src的加入降低了 Τ0ΡΚ的泛素化结合 水平。（见图6A)
[0145] 6.2我们用放线菌酮（CHX) (sigma公司）处理细胞阻滞新蛋白的合成，继而检测 Τ0ΡΚ在不同细胞中的表达衰减情况，发现Src增强Τ0ΡΚ的稳定性。具体如下：
[0146] 6 · 2 · 1我们瞬转pcDNA3-HA-T0PK(WT) (T0PK-WT)和pcDNA3-HA-T0PK(FF) (T0PK-FF) 到293T细胞，24h后用EGF(80ng/ml)刺激15分钟，然后加入100μg/ml CHX，分别在0h、6h和 12h收样，通过免疫印迹法检测HA的表达，反映 Τ0ΡΚ的衰减情况。结果发现:Y74Y272突变后 Τ0ΡΚ稳定性较野生型差。（见图6B)
[0147] 6.2.2我们在Src+/+、Src-Λ细胞模型中作如上CHX处理，结果也发现Src +/+中Τ0ΡΚ更 稳定。（见图6C)
[0148] 实施例三Τ0ΡΚ磷酸化抗体的制备。
[0149] 1.根据Τ0ΡΚ靶点序列及已知的磷酸化位点Y74和Y272,设计需要合成的磷酸化及 非磷酸化多肽序列。
[0150] p-T0PK(Y74) :NH2-Cys Asn Asp His p[Tyr]Ser Val Tyr Gin Lys Arg Leu Met Asp Glu-CONH2
[0151] NP-T0PK(Y74) :NH2-Cys Asn Asp His Tyr Ser Val Tyr Gin Lys Arg Leu Met Asp G1u-C0NH2
[0152] p-T0PK(Y272):NH2-Cys Asp Glu Ser Asp Phe Asp Asp Glu Ala Tyr p[Tyr] Ala-C0NH2
[0153] NP-T0PK(Y272):NH2~Cys Asp Glu Ser Asp Phe Asp Asp Glu Ala Tyr Tyr Ala-C0NH2
[0154] 2.制备磷酸化抗体。
[0155] 具体步骤如下：
[0156] 2.1根据设计的序列采用固相合成法合成多肽，用RP-HPLC条件进行纯化，并通过 ^：/^3鉴定，纯度>85%。
[0157] 2.2使用KLH载体蛋白偶联得到多肽，作抗原蛋白用。
[0158] 2.3免疫兔子，得到兔多抗血清，纯化血清。我们在第2天和第14天每只兔子免疫 200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫100ug抗原，期间采血做elisa 检测，转阳（1:4000即1: 4K，0D值>1)后收集30-50ml阳性血，通过两步亲和纯化法进行纯化。
[0159] Elisa检测流程如下：
[0160] 2.3.1将抗原按适当浓度溶解于包被液中，在对应的孔中加入lOOul抗原，4°C过 夜；
[0161 ] 2.3.2倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
[0162] 2 · 3 · 3每孔加入200μ1封闭液，37 °C孵育1小时；
[0163] 2.3.4倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
[0164] 2 · 3 · 5每孔加入100μΙ-抗，37 °C孵育1小时；
[0165] 2.3.6倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
[0166] 2 · 3 · 7每孔加入100μΙ二抗，37 °C孵育1小时；
[0167] 2.3.8倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；
[0168] 2.3.9拍干残留液体，每孔加入100μΙ显色液，37 °C避光显色10分钟；
[0169] 2.3.10每孔加5(^121出3〇4终止显色，并立即读取45〇11111〇0值。
[0170] 表1.血清Elisa检测结果如下：
[0171]
[0172] 3、通过E1 i s a验证磷酸化抗体符合标准，即磷酸化抗体与磷酸化肽的反应在 0.125ug/ml时有效0D值应大于或等于磷酸化抗体与非磷酸化肽反应在0.125ug/ml时有效 0D值的5倍。（见下表）
[0173] 表2.抗体Elisa检测结果如下：
[0174]
[0175] 实施例四p-T0PK(Y74)抗体在体外及细胞内的检测应用。
[0176] 1.体外激酶实验证实ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)识别Τ0ΡΚ的磷酸化。
[0177] 鉴于在实施例二的功能实验中我们发现Τ0ΡΚ的Υ74和Υ272这两个位点突变后产生 的效应一致，我们在此详细探讨双突变后体内外的Τ0ΡΚ磷酸化变化。首先我们利用亚克隆 技术对pET46-Hi S-T0PK的Υ74和Υ272位点进行了双突变(具体方法同实施例二（1))，再原核 表达出 pet46-His-T0PK(WT)、pet46-His-T0PK(74F)、pet46-His-T0PK(272F)和 pet46-His-T0H((FF)蛋白，然后以他们为底物，以Src为活性激酶进行体外激酶反应(方法同实施例 一），免疫印迹法检测P-T0PK(Y74)和p-T0PK(Y272)的表达，结果表明：p-T0PK(Y74)识别Src 激活的Τ0Η(，当位点突变后信号消失。（见图7A)而p-T0PK(Y272)不能特异性识别激活的 Τ0ΡΚ。
[0178] 2.证实p-TOPK (Υ74)抗体能识别EGF诱导的Sr c活化的Τ0ΡΚ。
[0179] 我们用 simple-fect 将外源 pcDNA4-His-Src(His-Src)和 pcDNA3-HA-T0PK(HA-Τ0ΡΚ)转入293T细胞，分别用EGF(80ng/ml)刺激30分钟，免疫印迹法检测P-T0PK(Y74)和P-Src(Y416)的表达。结果显示:EGF刺激后p-Src(Y416)的表达增强，ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)在共转入 His-Src和ΗΑ-Τ0ΡΚ组表达水平较单转ΗΑ-Τ0ΡΚ组高，且EGF刺激后信号更强。说明Src可在 Y74位点磷酸化Τ0ΡΚ，且抗体能识别此位点的磷酸化。（见图7B)
[0180] 3. p-TOPK (Y74)抗体识别EGF诱导的细胞内源性的Τ0ΡΚ磷酸化。
[0181] 以结肠癌细胞SW480为例，我们用EGF(80ng/ml)分别给予SW480细胞5分钟、15分钟 以及30分钟的刺激，收样，免疫印迹法检测p-TOPK (Y74)的表达，结果表明EGF作用后，细胞 内源性的Τ0ΡΚ磷酸化能被p-T0PK(Y74)抗体识别。（见图7C)
[0182] 4.我们在结肠癌细胞系中进一步证实，当Src活性被抑制后，Τ0ΡΚ的磷酸化水平下 降，且p-T0PK(Y74)抗体能够识别出这种变化。
[0183] 4.1 首先我们检测了四种结肠癌细胞系 HCT15、HCT116、DLDl、SW48(^Sr(^PT0PI^ 表达情况，选取Src表达相对较高的三种做后续实验。（见图7D)
[0184] 4.2达沙替尼(〇8831:;[11；[13,8611601<:公司）是一种众所周知的革E1向Src的小分子抑制 剂。在HCT116、HCT15和SW480三种细胞中，我们用10nM、20nM和50nM的dasatinib分别作用 24h后检测p-T0PK(Y74)的表达情况。结果表明：在三种细胞中，p-T0PK(Y74)的表达随p-Src (Y416)水平的下降而降低，具浓度依赖性。（见图7E)
[0185] 5.我们证实p-T0PK(Y74)在肺癌吉非替尼耐药细胞株中表达增强，其可能在肺癌 耐药的研究及临床应用中发挥作用。（见图8)
[0186] 6. p-TOPK (Υ74)抗体识别神经胶质瘤细胞中Τ0ΡΚ的磷酸化变化。
[0187] 以神经胶质瘤细胞U87为例，我们利用基因沉默技术将胶质瘤细胞中的Τ0ΡΚ沉默， 用ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)抗体检测到抗瘤药物替莫唑胺(TMZ)lOOuM作用48h后ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)的表达降 低。（见图9)。
【主权项】
1. 一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体，其特征在于是按包括以下步骤的方法 制备而成的： 1) 将氨基酸序列如SEQ ID Ν0:1所示的多肽与载体蛋白偶联，用作抗原； 2) 用步骤1)中的抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到抗体。2. -种抗Τ0ΡΚ第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体的制备方法，其特征在于包括以下步 骤： 1) 将氨基酸序列如SEQ ID Ν0:1所示的多肽与载体蛋白偶联，用作抗原； 2) 用步骤1)中的抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到抗体。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述载体蛋白为钥孔血蓝蛋白。4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:所述动物为兔。5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述免疫的方法是:在第2天和第14天每 只兔子免疫200ug抗原，再分别在第28天、第42天和第56天每只兔子免疫lOOug抗原。6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于:采用两步亲和纯化法进行纯化。7. 权利要求1所述抗T0PK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体在制备肿瘤诊断试剂盒中的 应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述肿瘤为结肠、肺癌和胶质瘤。
【专利摘要】本发明公开了一种抗TOPK第74位酪氨酸残基磷酸化的抗体，属于生物和疾病诊断领域。该抗体是将氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示的多肽与载体蛋白偶联，用作抗原，并用该抗原免疫动物，得到多抗血清，纯化后得到的。该抗体能应用于肿瘤细胞水平的免疫印迹方法检测，目前市面上尚无针对TOPK？Y74磷酸化检测的任何抗体，本发明为肿瘤发生的研究及肿瘤的早期诊断及预后预测治疗打下了坚实的基础。
【IPC分类】G01N33/574, C07K16/40, G01N33/68
【公开号】CN105646714
【申请号】
【发明人】朱峰, 段秋红, 肖娟娟, 王哲, 薛佩佩, 孙惠敏, 邵晨, 曾凡帆, 全纯涛, 卢涛, 刘琳, 袁萍, 柯昌庶, 熊华, 路慧, 尹燕华, 潘华雄
【申请人】华中科技大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月29日