c(His-Src)和 pcDNA3-HA-T0PK(HA-T0PK)到 293T 细胞 并用EGF刺激，利用免疫印迹法检测p-T0H((Y74)的表达。结果显示共转染His-Src和HA-Τ0ΡΚ后p-T0PK(Y74)的表达明显增强，EGF刺激后该表达进一步增加。
[0086] D.免疫印迹法检测EGF刺激后SW480中ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)的表达增强。
[0087] Ε.免疫印迹结果表明SW480、HCT15和HCT116细胞在不同浓度达沙替尼作用后，ρ-T0PK(Y74)的表达随着p-Src(Y416)的表达降低而降低，呈浓度依赖性。
[0088]图8:p-T0PK(Y74)在肺癌吉非替尼耐药株中的表达增强。
[0089] 图9:ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)检测ΤΜΖ作用后神经胶质瘤细胞U87中Τ0ΡΚ的磷酸化水平下降。
【具体实施方式】
[0090] 以下结合实施例对本发明进行详细地说明。需要说明的是，本发明的实施例仅限 于对本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验 操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照 本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
[0091] 实施例一确定Src是Τ0ΡΚ上游蛋白激酶，在Υ74和Υ272位点磷酸化Τ0ΡΚ。
[0092] 1.通过体外激酶实验发现活性的Src可磷酸化Τ0ΡΚ。
[0093]体外激酶实验具体步骤如下：
[0094] 1.1在E.coli BL21菌中表达并纯化Τ0ΡΚ蛋白：将pET46-His-T0PK-WT质粒转化进 E.coli BL21感受态细胞中，挑单菌落37°C过夜培养。过夜的菌再次接种，37°C振荡培养至 0D600为0.6~0.8,而后加入ImM IPTG 30°C振荡诱导4h，随后反复冻融裂解菌体，加入Ni-NTA-His-binding beads(购自QIAGEN公司），4°C孵育过夜，而后分别用PNI 20、PNI 40洗 涤，最后PNI 400洗脱，定量，电泳，考马斯亮蓝染色鉴定。
[0095] 1 · 2我们将制备好的Τ0ΡΚ蛋白2ug、Src活性激酶0 · 2ug(购自Mi 1 ipore公司）与1 X 激酶缓冲液一起在lmCi[ γ -32P]ATP存在下32°C孵育40分钟。
[0096] 1.3上述样品加入5 X上样缓冲液，电泳分离，通过放射自显影技术结果显示：在 Τ0ΡΚ位置有较强的磷酸化信号，说明Src可以磷酸化Τ0ΡΚ。（见图2A)
[0097] 2.利用NetPhos 2.0软件预测Τ0ΡΚ可被磷酸化修饰的酪氨酸位点。
[0098] Src是非受体酪氨酸蛋白激酶，我们利用NetPhos 2.0软件对Τ0ΡΚ蛋白序列的酪氨 酸位点进行分析预测，打分高者为潜在的磷酸化位点。结果显示:￥74、￥131、￥271、￥272和 Y290位点为Src磷酸化Τ0ΡΚ的潜在位点。（见图2B)
[0099] 3.通过肽谱磷酸化筛选出Src可磷酸化含Y74和Y272位点的肽段。
[0100] 首先我们将网站预测的5个可能位点合成相应的肽段，然后通过体外激酶实验(具 体步骤同1.2)，将活化的Src与5个不同肽段在lmCi[ γ-32Ρ]ΑΤΡ存在下一起孵育，结果显 示:含Υ74和Υ272位点的肽段可被激活，即Src可磷酸化这两个位点。（见图2C)
[0101] 4.荧光共聚焦结果显示Src和Τ0ΡΚ共定位。
[0102] 步骤如下：
[0103] 4.1准备细胞爬片：将无菌清洁盖片置于12孔板内，接种结肠癌细胞SW480于盖片 上。
[0104] 4.2培养24小时后，固定细胞:先将细胞用1.5ml冷ros轻洗3次，每次5分钟，再加入 1.5ml 1 %多聚甲醛孵育10分钟，吸弃多聚甲醛，加入1.5ml在-20°C提前预冷的100%甲醇， 孵育5分钟，然后吸弃甲醇，加入1.5ml-20°C提前预冷的80%丙酮，孵育2分钟，最后弃丙酮， 自然晾干5分钟。
[0105] 4.3免疫荧光染色：
[0106] 4.3.1每孔用 1.5ml PBS/0.05 % tween-20 振洗细胞 5 分钟。
[0107] 4.3.2每孔加入50111卩85/0.05%七￥6611-20/呢5封闭1小时。
[0108] 4 · 3 · 3加入Src/TOPK抗体，每孔50ul (Src : 1: 50，cell signaling公司，#2123) (Τ0ΡΚ: 1:50，Santa cruz公司，sc-393313)，4°C孵育过夜。
[0109] 4.3.4每孔用 1.5ml PBS/0.05 % tween-20洗，3次，每次 10分钟。
[0110] 4.3 · 5加入焚光标记二抗，每孔50ul (Alexa 546红色：1:1000，Invitrogen公司） (Alexa488绿色：1:1000，Invitrogen公司），室温避光孵育1小时。
[0111] 4 · 3 · 6每孔用1 · 5ml PBS/0 · 05 % tween-20洗，3次，每次15分钟，洗涤完后吸净盖片 上液体。
[0112] 4.4DAPI染核:取10ul DAPr混合物(Beyotime公司）滴加在细胞上，盖片覆盖封片， 避免气泡产生。
[0113] 4.5荧光共聚焦显相系统拍照：Src(红色）和Τ0ΡΚ(绿色）主要在胞浆内表达，大部 分融合成黄色，说明二者共定位。（见图2D)
[0114] 5 ·通过pul Ι-down实验证实Τ0ΡΚ在细胞内与Src结合。
[0115] 步骤如下（以SW480细胞为例）：
[0116] 5· 1用1 %CHAPS(Life Science Products&Services公司）裂解液裂解SW480细胞， 分装两管(500ug每管）。
[0117] 5.2分别取2〇111附-阶厶-把8-1^11(11^8111(附-。〇11廿〇1)和附-阶厶-把8-1'0?1((附-Τ0ΡΚ)，加入lml 1 %BSA封闭30分钟，3000rpm离心3分钟，弃上清。
[0118] 5.3将两管细胞裂解液分别加入上述附-(：〇11廿〇1和附-1'(^1(中4°(：颠倒孵育过夜。
[0119] 5.4 3000rpm离心3分钟，弃上清。加入lml 1 % CHAPS洗3次，每次5分钟，最后一次 弃尽上清。
[0120] 5.5加入50ul 1 % CHAPS，吹匀，加入12ul 5*上样缓冲液，95 °C，煮沸5分钟，上样电 泳。
[0121] 5.6免疫印迹结果显示Ni-TOPK可与细胞内Src结合。（见图2E)
[0122] 实施例二探讨Src磷酸化Τ0ΡΚ后对Τ0ΡΚ功能的影响。
[0123] 1.通过亚克隆技术对Τ0ΡΚ的Y74和Y272位点分别进行单突变及双突变。
[0124] 首先据两个位点酪氨酸突变成苯丙氨酸要求设计合成对应引物(上海英骏生物技 术有限公司合成），然后以PCDNA3-HA-T0PK为模板，进行PCR，分别得到突变后产物:单突变 pcDNA3-HA-T0PK(Y74F)，pcDNA3-HA-T0PK(Y272F)和双突变 pcDNA3-HA-T0PK(FF)，再转化到 T0P10,扩增后提取质粒。
[0125] 2.在JB6和SW480细胞系中建立过表达稳定细胞系，并做生长曲线比较各组细胞的 增殖变化。
[0126] 2.1利用8丨111?16?6(^(购自武汉信号曙光生物科技有限公司）将?〇0嫩3.1、？〇0嫩3-HA-T0PK(WT)、pcDNA3-HA-T0PK(Y74F)、pcDNA3-HA-T0PK(Y272F)和pcDNA3-HA-T0PK(FF)分 别转入JB6和SW480细胞中，通过G418(sigma公司）进行筛选得到JB6/mock、JB6/WT、JB6/ 74F、JB6/272F、JB6/FF和SW480/mock、SW480/WT、SW480/74F、SW480/272F、SW480/FF。
[0127] 2.2生长曲线测定:将细胞消化计2 X105个种入10cm皿，分别在24小时、48小时、72 小时和96小时消化计数，取平均值生成生长曲线。结果显示:在JB6和SW480稳定细胞系中， 突变组稳定细胞系较野生组细胞系增殖减慢。（见图3A、3B)
[0128] 3.通过软琼脂克隆形成实验发现突变后稳定细胞系克隆形成数减少，细胞锚定非 依赖性生长能力下降。
[0129] 步骤如下：
[0130] 3.1JB6细胞为正常表皮细胞，刺激后易转化，是研究肿瘤转化的常用模型。我们将 各种JB6稳定细胞系分为加 EGF和不加 EGF组，每组三个副孔的数量准备六孔板。首先配制混 有10%FBS的胶浓度为0.5%的BME(基本培养基，sigma公司），将其加入六孔板，每孔3ml，待 凝固后形成底胶。然后将各组细胞混入含有10%FBS的胶浓度为0.33%的BME中，充分混匀， 均匀滴加入各底胶之上，每孔lml，每孔细胞数8000，待上层胶凝固后置于37 °C，5 % C02培养 箱培养5-10天。最后拍照计克隆数比较各组差异。结果显示:EGF刺激后，突变各组与野生组 相比较，细胞形成的克隆明显小而少。（见图3C)
[0131] 3.2SW480为Τ0ΡΚ低表达的结肠肿瘤细胞，可形成克隆，无 EGF刺激组。方法同上。结 果显示:突变组较野生组细胞形成的克隆小而少。（见图3D)
[0132] 4.裸鼠体内成瘤实验证实Y74和Y272位点突变后细胞成瘤能力降低。
[0133] 我们将2.1中得到的SW480/WT和SW480/FF稳定细胞注射到裸鼠皮下，观察其成瘤 情况及组织蛋白表达情况，步骤如下：
[0134] 4.1将4-6周龄裸鼠（购自北京HFK生物科学有限公司）随机分为两组:WT和FF组，每 组8只。
[0135] 4.2分别消化SW480/WT和SW480/FF细胞，皮下注射到老鼠一侧，每只3 X 106个。
[0136] 4.3从注射细胞后21天开始，每隔一天测量肿瘤长、宽、高，计算其体积= 0.52(长 X宽X高）。结果显示：细胞注射30天，肿瘤体积大于100mm3后，FF组肿瘤增殖明显较WT组 慢，差异具统计学意义。（见图4B)
[0137] 4.4肿瘤体积达到1000mm3后处死老鼠，剥离瘤块，送病理科（西京医院病理科）固 定，包埋，切片，用于苏木素和伊红(H&E)染色以及p-Histone H3(SerlO)(cell signaling 公司，#3377s)免疫组织化学染色分析。瘤块体积图显示:与WT组相比较，FF组成瘤体积明显 减小。（见图4A)H&E结果显示：两组所形成的肿瘤均为低分化腺癌，具有高核浆比，核异质 性，细胞有丝分裂旺盛以及血管增多的特征。（见图4C左)Histone H3SerlO位点的磷酸化是 细胞有丝分裂的标记，且Τ0ΡΚ可在SerlO磷酸化Histone H3,所以我们通过免疫组织化学方 法检测p-Histone H3(Ser 10)的表达，染色结果显示:p-Histone H3(Ser 10)的表达在WT组 明显强于FF组。（见图4C右)这些结果说明Y74Y272位点突变后Τ0ΡΚ成瘤能力下降。
[0138] 5.细胞实验表明Src增强Τ0ΡΚ的活性。
[0139] 5.1我们将2.1中建立的JB6/WT和JB6/FF细胞系分别用EGF(20ng/ml)刺激15分钟， 然后采用免疫印迹技术检测P-Histone