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【发明内容】
[0029] 本发明的目的是：
[0030] 1)发现酪氨酸激酶Src是Τ0ΡΚ新的上游激酶，并确认了磷酸化位点:Y74和Y272。
[0031] 2)发现Src在Y74和Y272磷酸化修饰Τ0ΡΚ后影响了 Τ0ΡΚ的功能，与肿瘤发生密切相 关。
[0032] 3)制备了抗 Τ0ΡΚ 的 Y74 磷酸化抗体:p-T0PK(Y74)。
[0033] 4)确定制备的ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)抗体能应用于肿瘤细胞水平的Western blot检测。
[0034]本发明是这样实现的：
[0035] 1.确定Src是Τ0ΡΚ的直接上游激酶。
[0036] 1)通过生物信息学分析，我们发现Τ0ΡΚ的蛋白序列中存在着Src底物的磷酸化保 守序列：（pY[A/G/S/T/E/D])。
[0037] 2)运用体外激酶实验证实活性的Src可磷酸化修饰Τ0ΡΚ。
[0038] 3)运用NetPhos2.0软件对Τ0ΡΚ可能被磷酸化修饰的酪氨酸位点进行分析，并通过 肽谱磷酸化筛选，确定Τ0ΡΚ的Y74和Y272两个位点能被活性的Src磷酸化修饰。
[0039] 4)在细胞水平采用荧光共聚焦技术显示Src和Τ0ΡΚ在细胞内共定位。
[0040] 5)采用pulldown技术证实Src能与Τ0ΡΚ相互作用。
[0041 ] 2.确定Y74和Y272两个磷酸化位点对Τ0ΡΚ功能的重要性。
[0042] 1)采用定点突变技术制备了Τ0ΡΚ突变体，并建立相应突变体的稳定表达细胞系， 观察细胞表型变化。我们发现当Τ0ΡΚ的Y74和Y272被突变后，Τ0ΡΚ的促肿瘤发生能力降低， 表明Τ0ΡΚ的Y74、Y272位点促进肿瘤的发生。
[0043] 2)通过裸鼠体内成瘤实验证实稳定表达ΤΟΡΚ Υ74、Υ272突变体的细胞系成瘤能力 下降。
[0044] 3)采用Western blot技术证实在稳定表达Τ0ΡΚ的JB6细胞系及Src+/+、Src-Λ细胞 系中通过EGF刺激激活Src可磷酸化修饰Τ0ΡΚ并增强Τ0ΡΚ的活性。
[0045] 4)我们进一步在细胞水平证实Src磷酸化修饰Τ0ΡΚ增强Τ0ΡΚ的稳定性。
[0046] 3.制备抗ΤΟΡΚ Y74及Y272磷酸化抗体。
[0047] 1)设计合成多肽的序列。根据Τ0ΡΚ靶点序列及指定磷酸化位点Y74和Y272,设计需 要合成的磷酸化多肽序列。
[0048] 2)制备磷酸化抗体。根据设计的序列合成纯度高于90%的磷酸化多肽，然后进行 抗原偶联，并将偶联的磷酸化多肽免疫入兔，收集血清，采用两步亲合法纯化抗体。
[0049] 3) ELI SA 验证 T0PK-Y74、T0PK-Y272磷酸化抗体的效价。
[0050] 4.体内外验证抗ΤΟΡΚ Y74及Y272磷酸化抗体。
[0051 ] 1)体外激酶实验检测磷酸化抗体:p-T0PK(Y74)、p-T0PK(Y272)。其中p-T0PK(Y74) 抗体在体外激酶实验验证成功。
[0052] 2)细胞实验检测磷酸化抗体。在结肠癌细胞系中验证ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)。
[0053] 3)在肺癌吉非替尼耐药株中验证ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)的表达。
[0054] 4)在胶质瘤细胞系中验证ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)的表达。
[0055]本发明具有如下优点：
[0056] 1)本发明首次发现Src是Τ0ΡΚ直接上游激酶。
[0057] 2)Src是酪氨酸蛋白激酶，Τ0ΡΚ被预测有5个可能被磷酸化修饰的酪氨酸位点，本 发明首次发现Src直接磷酸化Τ0ΡΚ的Υ74和Υ272位点。
[0058] 3)首次发现Υ74和Υ272位点对Τ0ΡΚ功能影响重大，这两个位点磷酸化修饰会影响 Τ0ΡΚ的稳定性和活性，促进肿瘤发生。
[0059] 4)首次成功制备了 ρ-Τ0ΡΚ( Υ74)抗体，该抗体可用于细胞内检测。
[0060] 5)目前市面上尚无针对ΤΟΡΚ Υ74磷酸化检测的任何抗体，本发明首次确定ρ-ΤΟΡΚ (Υ74)抗体可用于western blot分析，为其应用于肿瘤发生的研究及肿瘤的早期诊断及预 后预测治疗打下了坚实的基础。
【附图说明】
[0061]图1:本发明技术路线图。
[0062] 图2:体外实验显示，Src可磷酸化Τ0ΡΚ的Y74和Y272位点。
[0063] A.体外激酶实验：用同位素放射自显影技术显示活化的Src能激活无活性的Τ0ΡΚ。 图中条带所示为磷酸化的Src和Τ0ΡΚ。
[0064] B.采用NetPhos 2.0软件找到Τ0ΡΚ潜在的酪氨酸活化位点。?'标注为预测打分较 尚的位点。
[0065] C.肽谱磷酸化实验筛选出Y74和Y272为Src磷酸化Τ0ΡΚ的位点。含有各不同位点的 肽段作为底物与活化的Src在γ-32P和ATP共同作用下反应显影，结果显示Y74和Y272可被 Src磷酸化。
[0066] D.免疫荧光实验通过荧光共聚焦显微镜显示Src(红色）与Τ0ΡΚ(绿色）共定位。二 者在胞浆和胞核均有表达，主要在胞浆表达。
[0067] E.pull down实验显示SW480细胞中Ni柱结合的Τ0ΡΚ能结合内源性的Src〇
[0068] 图3:细胞实验显示，Src在Y74和Y272位点磷酸化Τ0ΡΚ促进肿瘤细胞的转化。
[0069] (A)JB6 和（B)SW480 细胞系分别稳定转染口〇0嫩3-]?〇〇1^(邛6/]\1〇^〇4〇0嫩3-1'0?1(-WT(JB6/WT) .pcDNAS-TOHWdFQBeAdF)，pcDNA3-T0PK-272F(JB6/272F)，或double-mutant pcDNA3-T0PK-FF(JB6/FF)质粒后建立的JB6和SW480稳定细胞系生长曲线图。结果 显示与野生型(WT)细胞相比，单突变组(74F和272F)和双突变组(FF)细胞生长均减缓。（*P〈 0.05，**?〈0.01，差异具有统计学意义。）插入上面小图分别为邛6和31480稳定细胞系的免 疫印迹检测结果，显示转染成功。
[0070] (C)和(D)分别为JB6和SW480稳定细胞系的锚定非依赖克隆形成实验结果。（C)图 显示EGF刺激后与WT组比，JB6各突变组细胞克隆数小而少。（D)图结果显示与WT组相比较， SW480突变组细胞克隆数减少。
[0071] 图4:裸鼠成瘤实验显示，Src磷酸化Τ0ΡΚ促进结肠肿瘤的发生。
[0072] A.野生型SW480稳定细胞系（SW480/WT)和突变型SW480稳定细胞系（SW480/FF)在 裸鼠体内成瘤大小对比。结果显示，与SW480/WT组比，SW480/FF组形成的肿瘤明显减小。 [0073] B. SW480/WT和SW480/FF组裸鼠成瘤体积曲线图。从图中可以看出，从打入细胞30 天起，SW480/FF组的肿瘤体积明显小于SW480/WT。（*P〈0.05，林P〈0.01，差异具有统计学意 义。）
[0074] C.两组肿瘤的H&E染色及磷酸化Histone H3的IHC染色。H&E染色结果显示两组均 为低分化腺癌。磷酸化Histone H3在SW480/WT的表达较SW480/FF组显著增强。（标尺放大倍 数:400X)
[0075] 图5:细胞实验显示，Src磷酸化Τ0ΡΚ增强Τ0ΡΚ的活性。
[0076] 4』6?刺激后磷酸化把8切1^!13在邛6稳定细胞系：野生型组(贝6/11')和双突变组 (JB6/FF)中的表达变化。免疫印迹法显示JB6/FF组磷酸化Histone H3表达水平较JB6/WT组 降低。
[0077] B.EGF刺激后磷酸化Histone H3在Src+/+和Src-ΛMEF细胞中的表达变化。免疫印迹 法显示EGF刺激后磷酸化Histone H3在Src+/+MEF中的表达较Src+MEF高。
[0078] 图6:细胞实验证实，Src磷酸化修饰Τ0ΡΚ增强Τ0ΡΚ的稳定性。
[0079] A.Src 阻滞 Τ0ΡΚ 泛素化结合。pcDNA4-His-Src(His-Src)、pcDNA3-HA-T0PK(HA-Τ0ΡΚ)和pCMV-Flag-ubiquitin(Flag-Ub)瞬转入293T细胞，用HA抗体免疫沉淀Τ0ΡΚ后检测 Flag的表达情况。结果显示:转入His-Src组Τ0ΡΚ泛素化结合信号明显减弱。
[0080] Β.Τ0ΡΚ的Y74、Y272位点双突变后稳定性较Τ0ΡΚ野生型差。
[0081 ] C. Src+/+MEF细胞中Τ0ΡΚ蛋白较Src-ΛMEF细胞稳定。
[0082]图7:体外和细胞内实验显示ρ-Τ0ΡΚ(Υ74)抗体能检测至ljY74位点的活化。
[0083] A.体外激酶实验显示制备的p-T0PK(Y74)抗体能在体外识别该位点被活化。本实 验中用活化的Src分别与野生型Τ0ΡΚ原核表达蛋白（His-TOPK(WT))，单突变型（His-TOPK (74F))，单突变型(His-T0PK(Y272))及双突变型(His-TOPK(FF))在ATP作用下发生反应，免 疫印迹结果显示P-T0PK(Y74)的信号在His-TOPK(WT)组非常强，而His-T0PK(74F)和His-TOPK(FF)组未见明显信号。
[0084] B.免疫印迹法检测Src和Τ0ΡΚ在四种结肠癌细胞系HCT116、HCT15、DLDGPSW480* 的表达情况。
[0085] C.瞬时转染 pcDNA4-His-Sr