min， 收集上清，〇.45μπι孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化试剂盒操作步骤纯化重组 蛋白。
[0085] 1 · 1 · 18重组蛋白western blotting检测
[0086] 将纯化出的两个重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，从制胶板上将蛋白质胶取出，在夹 子上放置滤纸、NC膜、蛋白胶、滤纸，按顺序放好夹住，进行100V 60min转膜。取出NC膜TBST 洗4min，重复3~4遍，用现配的封闭液常温微摇封闭lh。取出NC膜TBST洗4min，重复3~4遍， 将NC膜在1:50稀释的S2免疫的绵羊血清中4°C孵育过夜。取出NC膜TBST洗4min，重复3~4 遍，将NC膜在驴抗绵羊IgG中常温微摇孵育lh。取出NC膜TBST洗4min，重复3~4遍，再用ECL 显色3min后照相。
[0087] 1.2实验结果
[0088] 1.2.1 GL_0002181 基因 PCR 扩增
[0089] S2GL_0002181编码基因序列与NCBI公布的6种布鲁氏菌基因序列进行BLAST比对， 比对结果见表2。发现基因 GL_0002181只在猪种、犬种、鼠种中存在，而在羊种、牛种、绵羊种 中不存在。
[0090] 表2 GL_0002181BLAST比对结果
[0091]
[0092] GL_0002181PCR扩增后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。结果表明：GL_ 0002181只在猪种布鲁氏菌核酸中扩增出约717bp条带，而在牛种和羊种布鲁氏菌核酸中 GL_0002181均未扩增出条带。
[0093] 1.2.2目的基因扩增
[0094] GL_0002181和BP26PCR扩增后，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。结果显示： GL_0002181和BP26分别出现约717bp、753bp条带，与预期的目的条带大小相符。
[0095] 1.2.3重组克隆菌?0?鉴定
[0096]目的片段与PMD19-T载体连接后转入感受态细胞，在固体培养基上培养12~16h， 挑取3个菌落接种到LB液体培养基，培养12~16h，再以菌液为模板PCR扩增，并进行1 %琼脂 糖凝胶电泳检测。GL_0002181和BP26基因克隆菌分别扩增出了约717bp、753bp条带，均获得 了预期大小的目的条带。
[0097] 1.2.4重组克隆质粒的双酶切鉴定
[0098] 经菌液PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒，用限制性内切酶(EcoR I、Xho I)进行双 酶切，酶切产物电泳检测，结果见图3、图4。结果均出现了两个条带，分别为GL_0002181 (0.7吐、2.7吐）、8?26(0.7吐、2.7吐），表明两个目的基因序列成功插入?1?)19-1'载体序列 中。
[0099] 1.2.5重组表达菌?0?鉴定
[0100]目的片段插入到pET30a载体后转化感受态菌体细胞，涂布在固体培养基上培养12 ~16h，挑取3个单菌落摇菌培养12~16h，以菌液为模板PCR扩增，进行1 %琼脂糖凝胶电泳 检测。GL_0002181和BP26分别扩增出约717bp、753bp的条带，与预期的目的条带大小相符。 [0101] 1.2.6重组表达质粒的双酶切鉴定
[0102]经PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒(按照Axygen质粒提取试剂盒说明书操作）用限 制性内切酶(EcoR I、Xho I)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图5、图6。结果均出现 两个条带，分别为GL_0002181(0.7kb、5.4kb)，BP26(0.7kb、5.4kb)，结果表明两个目的片段 成功插入表达载体pET30a中。
[0103] 1.2.7测序结果及分析
[0104] 经PCR鉴定和双酶切鉴定呈阳性的菌液进行双向测序，为了确保测序结果的准确 性，每个基因挑取3个独立的阳性菌株进行双向测序。双向测序得到的GL_0002181序列与全 基因组测序得到的GL_0002181基因核苷酸序列比对同源性均为100%。双向测序得到的 BP26序列与在NCBI公布的序列同源性为100%。说明61^_0002181及8?26成功克隆至载体 PMD19-T中，并成功构建重组表达载体。
[0105] 1.2.8重组表达菌诱导条件优化
[0106] 1.2.8.1重组表达菌诱导时间优化
[0107] 重组表达菌 BL21 (pETGL_0002181)和 BL21 (pETBP26)培养至 0D6QQ 达到0.6~1.0后， 加入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，分别在Oh、lh、2h、3h、4h、6h每个时间点各取2mL菌液，lmL 测吸光值〇D6Q()，另lmL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸10min，12% SDS-PAGE电泳检测，结果见图7、图8。结果表明：重组表达菌BL21(pETGL_0002181)和BL21 (PETBP26)与空菌BL21(DE3)、pET30和未诱导的重组菌比较，分别在31KDa、32KDa处多出了 一个条带，与预期的目的表达产物大小一致。
[0108] 1 · 2 · 8 · 2重组表达菌IPTG诱导浓度优化
[0109] 重组表达菌 BL21(pETGL_0002181)和 BL21(pETBP26)培养至 0D6QQ 达到0.6~1.0之 后，加入IPTG诱导剂至终浓度0 · 05mM、0 · lmM、0 · 2mM、0 · 5mM、1 · OmM、2 · OmM继续培养4h，取2mL 菌液，lmL测吸光值0D6qq，另lmL离心收集菌体，菌体沉淀物中加入蛋白上样缓冲液煮沸 10min，12%SDS-PAGE电泳检测，结果见图9、图10。结果表明 ：重组表达菌BL21(pETGL_ 0002181 )、BL21(pETBP26)与空菌BL21(DE3)、pET30和未诱导的重组菌相比分别在31KDa、 32KDa处多出了一个条带，这与预期的目的表达产物大小一致。从图可见，IPTG终浓度 0.05mM时各个重组表达菌与其他浓度的IPTG诱导相比表达量明显低，而IPTG终浓度0.1 mM、 0.2mM、0.5mM、1. OmM、2. OmM时各个重组菌表达量没有明显差异，为保证重组蛋白的高效表 达，诱导剂IPTG最佳诱导浓度确定为较高的浓度l.OmM。
[0110] 1.2.8.3重组表达菌诱导温度优化
[0111] 重组表达菌BL21 (pETGL_0002181)、BL21 (pETBP26)培养至0D6QQ 0 · 6~1 · 0时加入 IPTG诱导剂至终浓度1. OmM，分别在25 °C、30 °C、37 °C下，150r/min培养4h后各取2mL菌液， lmL测吸光值0D6Q()，另lmL离心收集菌体，加入蛋白上样缓冲液煮沸lOmin，12 % SDS-PAGE电 泳检测，结果见图11、图12。从图可以看出2个重组蛋白在25°C诱导表达量明显比30°C、37°C 诱导表达量低，从OD6QQ和蛋白条带可见30°C、37°C诱导表达量没有明显差异。根据重组蛋白 不同温度下生长情况，2个重组蛋白最佳诱导温度定为37°C，结果见图13。
[0112] 1.2.9最佳诱导条件下重组蛋白表达形式的检测
[0113]确定重组蛋白最佳诱导条件后，诱导表达重组菌，离心收集菌体沉淀，裂解菌体， 离心收集沉淀和上清，进行12%SDS-PAGE电泳，发现两个重组蛋白都以包涵体形式存在，结 果见图14。
[0114] 1.2.10重组蛋白包涵体溶解及蛋白纯化
[0115] 两个基因重组表达菌诱导培养后，离心收集菌体，裂解，离心收集的沉淀用8M尿素 溶解;再离心收集上清液，〇. 45μπι孔径滤器过滤后按照上海生工Ni+柱蛋白纯化步骤过柱子 纯化蛋白，得到了较纯的重组蛋白，结果见图15。
[0116] 1.2.11 重组蛋白 Western-bloting 检测
[0117]以Mouse Anti-His. tag IgG为抗体做Western-Blotting检测，两个重组菌BL21 (pETGL_0002181)及BL21(pETBP26)分别在31KDa、32KDa处出现了特异性条带，证明重组蛋 白融合表达了PET30表达载体上的His标签，结果见图16。
[0118] 以S2免疫绵羊血清作为抗体检测，重组蛋白GL_0002181及BP26与空菌BL21(DE3) 比较，分别在3 lKDa、32KDa处出现了特异性条带，表明重组蛋白能够与S2免疫血清中的抗体 发生特异性反应，具有较好的免疫原性。而重组蛋白GL_0002181与自然感染血清不反应，重 组蛋白BP26与自然感染血清反应，说明GL_0002181基因是S2特有的，而在自然羊种/牛种流 行株中不存在，结果见图17、图18。
[0119] 实施例2 IELISA鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法
[0120] 2.1实验方法
[0121 ] 2.1.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
[0122]按照棋盘滴定法，将实施例1中纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，稀释梯 度为1:25、1:50、1:100、1: 200四个梯度，抗原初始浓度分别为GL_0002181 (0 ·421mg/mL)、 BP26(0.553m