g/ml)，每孔加100μ1，4°C包被过夜，第二天弃掉孔内液体，用洗涤液洗三次，每 次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μ1封闭液，在37°C放置2h，用洗 涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。将已知阳性、阴性血清按 1 :50、1:100、1:200、1:400的四个梯度进行稀释，每孔加10(^1稀释好的血清，37°(：放置111， 用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μ1按1: 7000稀释的驴抗绵羊IgG-HRP，37°C放置30min，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束 后拍干酶标板孔内的液体。每孔加1〇〇μ1 TMB显色液，37°C显色10min。显色结束后，每孔加 100μ1终止液终止反应，并在酶标仪上读取0D45Q值。根据0D45Q值计算每组的P/N值，P/N =实 验组/对照组=〇D阳性血清/0D阴性血清，P/N值最大时所对应的抗原稀释度和血清稀释度 为最佳稀释度。
[0123] 2.1.2二抗最佳最佳浓度的确定
[0124] 按照棋盘滴定法，将纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，稀释梯度为1:25、 1:50、1:100、1:200共四个梯度，抗原初始浓度分别为GL_0002181(0.421mg/mL)、BP26 (0.553mg/ml)，按上述操作方法进行抗原包被、洗涤、封闭和阴阳性血清的稀释。驴抗绵羊 IgG-HRP按 1:5000、1:7500、1:10000、1:15000四个梯度稀释，每孔加 100μΙ，进行IELISA试 验。根据〇D45Q值计算每个二抗稀释度的Ρ/Ν值，Ρ/Ν值最大时所对应的二抗稀释度即为最佳 二抗稀释度。
[0125] 2.1.3重复性实验
[0126] 对2份阳性血清和2份绵羊阴性血清进行IELISA检测，每个样品重复3次，计算每个 样品标准差。
[0127] 2.1.4判定点的确定
[0128] GL_0002181和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通 过SPSS软件R0C分析，确认两个重组抗原IELISA判定点。
[0129] 2.1.5敏感性和特异性实验
[0130] GL_0002181和BP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通 过SPSS软件分析，确认两个重组抗原IELISA敏感性和特异性。
[0131] 2.1.6田间实验
[0132] 将待检的血清进行IELISA检测，比较两种抗原的阳性检出率。
[0133] 2.2实验结果
[0134] 2.2.1最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
[0135] 将纯化好的GL_0002181和Bp26抗原按四个梯度稀释，已知阳性血清和阴性血清按 四个梯度稀释，进行IELISA检测，根据IELISA显色后的颜色和0D 45Q值能看出阳性、阴性血清 颜色和0D45q值大小存在明显差异，结果见表3、表4。根据P/N值计算出抗原最佳包被浓度为 1:100,血清最佳稀释度为1:100,结果见表5、表6。
[0136] 表3 GL_0002181抗原棋盘滴定OD450值
[0137]
[0138]
-
[0139] 表4 BP26抗原棋盘滴定OD450值
[0140]
[0141] 表.5 GL_0002181抗原对应的P/N值
[0142]
[0143] 表.6BP26抗原对应的P/N值
[0144]
[0145] 2.2.2酶标二抗最佳稀释度的确定
[0146] 根据IELISA显色终止反应的颜色及计算P/N值大小，确定酶标二抗最佳稀释度为 1:7500,结果见表7、表8。
[0147] 表7 GL_0002181酶标二抗最佳工作浓度的确定
[0148]
[0149] 表8 BP26酶标二抗最佳工作浓度的确定
[0150]
[0151] 2.2.3重复实验
[0152] 选取2份阳性血清和阴性血清，用两种重组抗原IELISA检测，每个样品重复3次。3 次重复〇D45q差异不明显，表明两种重组抗原建立的IELISA检测方法均具有较好的重复性， 结果如表9。
[0153] 表9重组抗原重复实验0D45Q值及SD值
[0154]
[0155] 2.2.4判定点的确定
[0156] GL_0002181和BP26抗原用iELISA法检测血清，0D45Q值结果见表10、表11。利用SPSS 软件根据OD45Q值进行ROC分析，确定重组抗原GL_0002181 iELISA判定点为0.551，重组抗原 BP26iELISA判定点为0.589，判定点分析见图19、图20。重组抗原GL_0002181 R0C分析曲线 下面积为0.993，重组抗原BP26 R0C分析曲线下面积为0.965，2个重组抗原R0C分析曲线下 面积均接近1，说明2个重组抗原iELISA检测法可靠性高，结果见图21、图22。
[0157] 表.10 GL_0002181判定点OD450值
[0158]
[0159] 表11 BP26 判定点 OD450 值
[0160] luioi j z. z.
[0162] GL_0002181和BP26抗原检测20份背景清楚的布鲁氏菌自然感染血清及30份布鲁 氏菌S2免疫血清，通过SPSS软件分析发现重组抗原GL_0002181IELISA敏感性为95%、特异 性为93.3%，重组抗原BP26IELISA敏感性为90%、特异性为86.7%，具体结果见图19、图20。
[0163] 2.2.6田间实验
[0164] 对180份SAT及RBPT检测呈阳性的布鲁氏菌感染血清进行IELISA检测，以GL_ 0002181抗原检测出64个阳性，BP26检测出176个阳性，说明180份血清中有64个为S2疫苗抗 体阳性绵羊。GL_0002181抗原IELISA检测方法检出S2疫苗抗体阳性率为35.5% (64/180)， 而BP26抗原IELISA检测方法检出阳性率为98.8% (176/180)，说明在SAT及RBPT检测呈阳性 的家畜中，存在疫苗抗体干扰检测的假阳性。GL_0002181可用于布鲁氏菌S2疫苗感染与羊 种/牛种布鲁氏菌自然感染的鉴别，结果见表12。
[0165] 表12田间实验结果
[0166]
[016/」 口」见，小及明厘立的IbLlbA金別愰测力法ME金別W坟田兄坟与目然恐栄的仲晉K 菌病，且该方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
[0168]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. GL_0002181抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No.l所示，或该序列经 替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 权利要求1所述GL_0002181抗原蛋白的编码基因。3. 用于扩增权利要求2所述基因的特异性PCR引物。4. 权利要求1所述GL_0002181抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感 染的IELISA检测试剂中的应用。5. 家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，其特征在于，所述 IELISA检测试剂的有效成分为权利要求1所述GL_0002181抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋 白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。6. 鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的胶体金试纸条，其特征在于，所述试 纸条上包被有权利要求1所述GL_0002181抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端 或C端融合有His标签的重组蛋白。7. 家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒中包含权利要求6所述的IELISA检测试剂。
【专利摘要】本发明提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，所述IELISA检测试剂的有效成分为布鲁氏菌S2疫苗株基因GL_0002181编码的抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌主要流行株—羊种/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗—S2疫苗，能够在短时间内鉴别家畜血清中疫苗免疫与羊种/牛种布鲁氏菌自然感染抗体，解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测和畜群净化的难题。不仅可带来社会经济效益，而且可为净化畜群中的布鲁氏菌病做出贡献。
【IPC分类】C12N15/31, G01N33/569, G01N33/68, C07K14/23, C12N15/11
【公开号】CN105646680
【申请号】
【发明人】王文龙, 红梅, 呼和巴特尔, 刘春霞, 刘宁
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月6日