家畜s2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的ielisa检测试剂的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛 种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella)引起的全世界范围内广泛 流行的人兽共患，0ΙΕ归为乙类传染病。布鲁氏菌分七个种，牛种（B . abortus)、羊种 (B.melitensis)、猪种（B. suis)、犬种(B. cains)、绵羊种（B.ovis)、森林鼠种布鲁氏菌 (B.neotomae)、海洋哺乳动物布鲁氏菌(B.meris)，羊种、牛种为主要流行病原种类。布鲁氏 菌病传染方式为接触患病动物、未消毒的肉制品、乳制品，也可经呼吸道、消化道及皮肤黏 膜等组织器官侵入体内引起感染。
[0003] 布鲁氏菌一旦进入宿主体内，细菌侵入血液和淋巴管，繁殖并被巨噬细胞吞噬。家 畜感染布鲁氏菌病常见的症状有母畜流产、公畜睾丸肿大、严重者肝脏和脾脏等内脏肿大。 家畜感染布鲁氏菌多以淘汰为主，为此，严重影响了畜牧业的健康发展，而且威胁到了人类 的健康。
[0004] 近年来，我国布鲁氏菌病的流行较为严重，已经受到各级政府部门、科研工作者和 广大人民群众的广泛关注。传统疫苗很难达到理想的保护免疫水平，并且目前的诊断方法 无法辨别布鲁氏菌疫苗免疫与自然感染，而近年来研究的一些鉴别诊断方法不能很好地在 生产实践中鉴别S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染，因此，很难做到在免疫畜群中净化布 鲁氏菌自然感染病畜。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测 试剂。
[0006] 本发明的另一目的是提供用于鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的 IELISA检测试剂盒。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明针对市场上普遍使用的布鲁氏菌主流疫苗一S2疫 苗，对S2疫苗进行全基因组测序及生物信息学分析。找出与羊/牛种布鲁氏菌相比较S2疫苗 株的特有基因，基因重组表达后，筛选出具有免疫原性的抗原蛋白，建立布鲁氏菌S2疫苗免 疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA鉴别方法。
[0008] 本发明首先提供GL_0002181抗原蛋白，其氨基酸序列如Seq ID No.l所示，或该序 列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该GL_ 0002181抗原蛋白由52疫苗株基因61^_0002181(569 10吣.2)编码。
[0009] 本发明还提供用于扩增S2疫苗株基因 GL_0002181的特异性PCR引物。
[0010]本发明还提供所述GL_0002181抗原蛋白在制备家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏 菌感染的IELISA检测试剂中的应用。
[0011] 本发明还提供家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的IELISA检测试剂，所述 IELISA检测试剂的有效成分为上述GL_0002181抗原蛋白以及布鲁氏菌BP26蛋白，或者它们 的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
[0012] 本发明还提供含有上述IELISA检测试剂的家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感 染的IELISA检测试剂盒。
[0013] 本发明进一步提供一种鉴别家畜S2疫苗免疫与羊/牛种布鲁氏菌感染的方法，提 取待测家畜的血清，用上述IELISA检测试剂进行检测，比较两种抗原蛋白的阳性检出率。如 果IELISA检测结果为两种抗原蛋白均为阳性，则待测家畜血清中含有S2疫苗免疫产生的抗 体;如果GL_0002181抗原蛋白检测为阴性，BP26蛋白检测为阳性，则待检家畜为羊种或牛种 布鲁氏菌自然感染。上述鉴别方法同样适用于感染布鲁氏菌的人血清的检测。
[0014] 实验表明，本发明建立的IELISA鉴别方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏 感性。
[0015] 本发明提供的IELISA检测试剂能鉴别布鲁氏菌中毒力强、危害大的主要流行病 原一羊/牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的主流疫苗一 S2疫苗。因此，能够在短时间内鉴别 家畜血清中疫苗免疫与自然感染抗体，解决免疫畜群中疫苗抗体干扰布病检测(假阳性)和 畜群净化的难题。不仅可带来社会经济效益，而且可为净化畜群中的布鲁氏菌病做出贡献。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施例1中布鲁氏菌S2疫苗株特有基因 GL_0002181的PCR检测结果； 其中，Μ为DNA Marker DL2000;1为羊种菌;2为S2疫苗;3为牛种菌。
[0017] 图2为本发明实施例1中基因 GL_0002181及BP26的PCR扩增电泳图；其中，Μ为DNA Marker DL2000; 1为基因 GL_0002181; 2为基因 ΒΡ26; 3为空白对照。
[0018] 图3为本发明实施例1中重组克隆质粒GL_0002181双酶切鉴定结果；其中，Μ为DNA Marker DL2000; 1-3为基因 GL_0002181。
[0019] 图4为本发明实施例1中重组克隆质粒BP26双酶切鉴定结果;其中，Μ为DNA Marker DL2000;l-3 为基因 BP26。
[0020] 图5为本发明实施例1中重组表达质粒GL_0002181双酶切鉴定结果;其中，Ml为DNA Marker DL2000;M2为DNA Marker DL15000; 1-3为基因 GL_0002181。
[0021] 图6为本发明实施例1中重组表达质粒BP26双酶切鉴定结果；其中，Ml为DNA Marker DL2000; M2为DNA Marker DL15000; 1-3为基因 BP26。
[0022] 图7为本发明实施例1中重组表达菌BL21 (pETGL_0002181)诱导时间优化SDS-PAGE 电泳结果;其中，Μ为蛋白质marker; 1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-9为 pETGL_0002181 Oh、1 h、2h、3h、4h、6h 诱导表达菌。
[0023] 图8为本发明实施例1中重组表达菌BL21 (pETBP26)诱导时间优化SDS-PAGE电泳结 果；其中，Μ为蛋白质marker;l为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后；4-9为 pETBP260h、lh、2h、3h、4h、6h 诱导表达菌。
[0024] 图9为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETGL_0002181)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，Μ为蛋白质marker; 1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后； 4-9为IPTG终浓度为0 · 05mM、0 · lmM、0 · 2mM、0 · 5mM、1 · 0mM、2 · OmM时诱导BL21 (pETGL_ 0002181)表达。
[0025] 图10为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导剂浓度优化SDS-PAGE电 泳结果；其中，Μ为蛋白质marker; 1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后;4-9为 IPTG 终浓度为(h05mM、(hlmM、(h2mM、(h5mM、l·0mM、2·0mM时诱导BL21(pETBP26)表达。
[0026] 图11为本发明实施例1中重组表达菌BL21 (pETGL_0002181)诱导温度优化SDS-PAGE电泳结果；其中，Μ为蛋白质marker; 1为BL21空菌；2为pET30诱导前；3为pET30诱导后； 4-6 为 BL21(pETGL_0002181)25°C、30°C、37°C 诱导表达。
[0027] 图12为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETBP26)诱导温度优化SDS-PAGE电泳 结果;其中，Μ为蛋白质marker; 1为BL21空菌;2为pET30诱导前;3为pET30诱导后;4-6为BL21 (pETBP26)25°C、30°C、37°C 诱导表达。
[0028]图13为本发明实施例1中重组菌在不同温度下生长情况。
[0029]图14为本发明实施例1中两个重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果;其中， Μ 为蛋白质marker; 1 为BL21 (pETGL_0002181)菌体裂解物上清；2 为BL21 (pETGL_0002181)菌 体裂解物沉淀;3为BL21 (pETBP26)菌体裂解物上清;4为BL21 (pETBP26)菌体裂解物沉淀。
[0030]图15为本发明实施例1中两个纯化的重组蛋白SDS-PAGE电泳检测结果;其中，Μ为 蛋白质marker; 1为纯化的重组蛋白GL_0002181;2为纯化的重组蛋白ΒΡ26。
[0031 ] 图16为本发明实施例1中重组蛋白His标签Western-bloting检测结果；其中，Μ为 蛋白质marker; 1 为BL21 (pETGL_0002181); 2为BL21 (ρΕΤΒΡ26) 〇
[0032] 图17为本发明实施例1中纯化重组蛋白BL21(pETGL_0002181)与S2免疫血清反应 检测结果；其中，Μ为蛋白质marker; 1为BL21; 2为BL21 (pETGL_