20次(每次破碎 的持续时间为2s，每2次破碎之间的间隔时间为4s )，而后收集上清；
[0184] 3)取缓冲液A，以2.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱;取步骤2)上清液， 以lmL/min的流速上样;取缓冲液B，以0.8mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱 液;取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处 溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述蛋白质；
[0185] 其中所述缓冲液A是含有1.5mM EDTA的PBS缓冲液；
[0186] 所述缓冲液B是含有1.5mM EDTA、15mM谷胱甘肽的PBS缓冲液。
[0187]实施例3(-种氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白质制备方法）
[0188] 1)取重组大肠杆菌E.coli DH5apGEX-4T-Aip3培养，至培养液0D600nm为0.9时加 入诱导剂IPTG至终浓度为1.2mM，而后于39°C、震荡条件下诱导培养5h;
[0189] 2)收集菌体、破碎、收集上清；
[0190] 3)取缓冲液A，以3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱;取步骤2)上清液， 以2mL/min的流速上样;取缓冲液B，以1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱 液;取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以3.5mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处 溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述蛋白质；
[0191] 其中所述缓冲液A是含有2.5mM EDTA的PBS缓冲液；
[0192] 所述缓冲液B是含有2.5mM EDTA、25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液。
[0193] 实施例4(一种氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白质制备方法）
[0194] 1)取重组大肠杆菌E.coli DH5apGEX-4T-Aip3培养，至培养液0D600nm为0.7时加 入诱导剂IPTG至终浓度为0.9mM，而后于37°C、震荡条件下诱导培养4.5h;
[0195] 2)收集菌体，将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎30次(每次破碎 的持续时间为4s，每2次破碎之间的间隔时间为6s )，而后收集上清；
[0196] 3)取步骤2)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥， 即得到所述蛋白质。
[0197] 实施例5(实施例2所制备蛋白分别对单核增生李斯特菌、大肠杆菌0157 : H7、鼠伤 寒沙门氏菌的氨苄青霉素敏感性影响实验）
[0198] 单核增生李斯特菌、大肠杆菌0157: H7和鼠伤寒沙门氏菌均与长双歧杆菌特异性 蛋白Aip3共培养2h，进行活菌计数后分别将三种致病菌等量转接到加入不同浓度氨苄的等 体积LB液体培养基，对黏附蛋白处理组和GST处理组进行活菌计数对比。具体方法如下：
[0199] (1)用无菌PBS溶液将黏附蛋白Aip3分别稀释至浓度均为45yg/mL，GST作为对照稀 释至相同浓度，4°C保存备用。
[0200] (2)单核增生李斯特菌培养至对数中期，8000r/min，4°C条件下离心5min后，收集 菌体，无菌PBS洗涤3次，分别用GST稀释液、黏附蛋白Aip3稀释液重悬菌体，稀释至细菌浓度 均为106CFU/mL，于37 °C细菌培养震荡器处理2h。
[0201] (3)分别等量接种黏附蛋白处理过和GST处理的单核增生李斯特菌、大肠杆菌 0157:H7和鼠伤寒沙门氏菌于2mL加入不同浓度的氨苄LB液体培养基，氨苄浓度梯度为50， 25，10，1，0.1以 8/1^，均于37°(：恒温震荡培养箱中培养611，进行活菌计数。实验结果见图2。
[0202] 如图2所示，与对照组相比较，被粘附蛋白处理后的微生物在抗生素的作用下抑菌 效果更为明显，由于抗生素〇点处对照组与粘附蛋白处理组的生物量水平相当，因此可以认 为粘附蛋白本身并不具有直接的抑菌效果，而仅起到抗生素抑菌增效作用。
[0203] 实施例6(实施例2所制备蛋白分别对单核增生李斯特菌、大肠杆菌0157 : H7、鼠伤 寒沙门氏菌的青霉素 G敏感性、头孢霉素敏感性、卡那霉素敏感性、氯霉素敏感性影响实验）
[0204] 单核增生李斯特菌、大肠杆菌0157: H7和鼠伤寒沙门氏菌均与长双歧杆菌特异性 蛋白Aip3共培养2h，进行活菌计数后分别将三种致病菌等量转接到加入不同浓度氨苄的等 体积LB液体培养基，对黏附蛋白处理组和GST处理组进行活菌计数对比。具体方法如下： [0205] (1)用无菌PBS溶液将黏附蛋白Aip3分别稀释至浓度均为55yg/mL，GST作为对照稀 释至相同浓度，4°C保存备用。
[0206] (2)单核增生李斯特菌培养至对数中期，8000r/min，4°C条件下离心5min后，收集 菌体，无菌PBS洗涤3次，分别用GST稀释液、黏附蛋白Aip3稀释液重悬菌体，稀释至细菌浓度 均为106CFU/mL，于37 °C细菌培养震荡器处理2h。
[0207] (3)分别等量接种黏附蛋白处理过和GST处理的单核增生李斯特菌、大肠杆菌 0157: H7和鼠伤寒沙门氏菌于2mL加入浓度分别为lyg/mL青霉素 G、lyg/mL头孢霉素、2yg/mL 卡那霉素或2yg/mL氯霉素的LB液体培养基，均于37°C恒温震荡培养箱中培养6h，进行活菌 计数。结果见图3。
[0208] 如图3所示，黏附蛋白处理后的微生物在抗生素作用下受到了更为突出的抑制，菌 体密度普遍为对照组的1/10以下，由此可见，本发明长双歧杆菌蛋白质具有确切、显著的抑 菌增效作用。
[0209] 以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种长双歧杆菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。2. -种权利要求1所述长双歧杆菌蛋白质的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株； 2) 取步骤1)所述长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，至培养液 0D600nm为0.6~0.9时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8~1.2mM，而后于35~39°C、震荡条件 下诱导培养4~5h; 3) 收集菌体、破碎、收集上清； 4) 取步骤3)上清液，利用GST亲和层析纯化，收集洗脱液后超滤浓缩，脱盐，干燥，即得 到所述长双歧杆菌蛋白质。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤3)所述的破碎是将菌体重悬于PBS 缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎20~30次，每次破碎的持续时间为2~4s，每2次破碎之间 的时间间隔为4~6s。4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以下操作： a) 取缓冲液A，以2.5~3.5mL/min的流速平衡谷胱甘肽琼脂糖树脂柱； b) 取步骤2)上清液，以1~2mL/min的流速上样； c) 取缓冲液B，以0.8~1.2mL/min的流速洗脱，收集洗脱峰处溶液即为洗脱液； d) 取洗脱液超滤浓缩，而后过脱盐柱，再利用纯水以2.5~3.5mL/min的流速洗脱，收集 洗脱峰处溶液即为第二洗脱液，而后冷冻干燥，即得到所述长双歧杆菌蛋白质； 其中所述缓冲液A是含有1.5~2.5mM EDTA的PBS缓冲液； 所述缓冲液B是含有1.5~2.5mM EDTA、15~25mM谷胱甘肽的PBS缓冲液。5. -种权利要求1所述长双歧杆菌蛋白质用于提升微生物对抗生素敏感性的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗生素是β-内酰胺类抗生素。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗生素是氨基糖苷类抗生素。8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗生素是酰胺醇类抗生素。9. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述微生物是单核增生李斯特菌、大肠杆菌 或鼠伤寒沙门氏菌。10. 根据权利要求5所述的应用，其特征于所述应用是利用含有浓度为45~55yg/mL的、 氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白质溶液，以接触方式处理微生物。
【专利摘要】本发明提供了一种来源于长双歧杆菌的粘附蛋白，并明确了其氨基酸序列；在此基础上基于遗传工程技术获得了一株该蛋白的表达菌株，并针对菌株及粘附蛋白的特性从诱导表达、层析纯化、超滤浓缩等方面进行创新性设计，进而获得了上述粘附蛋白的高效制备方法。进一步的，实验发现该粘附蛋白不仅能够粘附于肠上皮细胞，而且具有提升微生物抗生素敏感性的作用，基于这种有益的发现，确定了该蛋白作为抗生素抑菌增效剂的用途，从而扩展了其用途范围，同时提供了一种提升微生物药敏性的新途径。本发明基于严谨的实验手段获得了突出的技术效果，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C07K14/195, A61K38/16, A61P37/04, C12N15/70, C07K1/22, A61P31/04
【公开号】CN105646679
【申请号】
【发明人】徐锋, 杨栋, 魏华, 武晓丽, 蔚晓敏, 吴姚平
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月26日