[0042] 以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂;所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值;以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0043] 实施例1(制备长双歧杆菌蛋白质的重组大肠杆菌表达菌株）
[0044] 1.1实验材料
[0045] 1.1.1菌株与载体
[0046] 长双歧杆菌，大肠杆菌DH5a，载体PGEX-4T-1均自市面购得。
[0047] 1.1.2常用试剂
[0048] (1)TE缓冲液（pH 8.0):10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，lmmol/L EDTANa2(pH 8.0)。配置后高压灭菌，室温贮存。
[0049] (2)1011^/1^溶菌酶：10011^溶菌酶溶解于101^(1(1!1 20中，-20°(：保存备用。
[0050] (3)10%SDS:5g SDS加 ddH20溶解定容至50mL。
[0051 ] (4)3M KAc:14.72g KAc溶解于ddH20中并定容至50mL。
[0052] (5)3M NaAc:12.35g NaAc溶解于ddH20中并定容至50mL。
[0053] (6)0·1Μ CaCl2:ll.lg CaCl2溶解于lOOOmL ddH20中，121°C高压灭菌 15min，于4°C 保存。
[0054] (7)50XTAE 电泳 buffer:12.2g Tris，2.85mL 冰醋酸，lOmL 0.25mol/L EDTA (pH8 · 0)，加 ddH20溶解定容至50mL。
[0055] (8)6X loading buffer(上样缓冲液）：0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚蓝，30%甘 油。
[0056] 1.1.3常用培养基
[0057] (l)MRS培养基：牛肉膏3g，酵母粉5g，吐温801mL，MgS〇4 · 7H20 0.6406g，K2HP〇45g， 冰乙酸4.3mL，MnS〇4 · H2O 0.13g，蛋白胨7g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g，际胨7g，朽1檬酸铵2g，L-半胱氨酸0 · 5g，加 ddH2〇至1000mL，调pH为6 · 5，然后115 °C高压灭菌15min。
[0058] (2)LB液体培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加 ddH20至1000mL，调pH至 7 · 0，121 °C 高压灭菌15min。
[0059] (3) LB平板的制备:在LB液体培养基按1.5 % (w/v)加入琼脂粉，121°C高压灭菌后 倒平板。
[0060] (4)LB/Amp(Ampicillin，氨苄青霉素)平板的制备:在LB液体培养基按1.5%(w/v) 加入琼脂粉，然后121°C高压灭菌后冷却至不烫手（约50°C)，加入100mg/mL的Amp至终浓度 为50yg/mL，混勾后倒平板，并置于超净工作台瞭干备用。
[0061 ] 1.2实验方法
[0062] 1.2.1长双歧杆菌基因组DNA的提取与检测
[0063] 1.2.1.1双歧杆菌基因组DNA的提取
[0064]提取长双歧杆菌的基因组DNA，本实验采用"溶菌酶-SDS-醋酸钾"法，具体方法如 下：
[0065] (1)将双歧杆菌接种于盛有MRS液体培养基的试管中，37°C条件下静置厌氧培养 Mlo
[0066] (2)用lmL吸管移取中管底部的双歧杆菌，置于2mL离心管中。
[0067] (3)离心(4500rpm，5min)，弃上清，剩余管底约0· lg湿菌体。
[0068] (4)加 lmL TE(pH 8.0)重悬洗涤一次，离心（4500rpm，5min)，弃上清。
[0069] (5)加入0.7mL TE(pH 8.0)和O.lmL 10mg/mL的溶菌酶，用移液器吹打，使菌体均 匀悬浮于溶液中。
[0070] (6)置40 °C水浴作用3h，期间颠倒混匀数次。
[0071] (7)迅速加入O.lmL 10%SDS，上下倒匀后置40°C水浴作用lh。
[0072] (8)离心（lOOOOrpm，5min，4°C)，移取0.5mL上清液于新2mL离心管中，弃沉淀。
[0073] (9)加入0· lmL(约1/6体积)冰预冷的KAc(3M)，置冰水浴15min。
[0074] (10)离心（12000rpm，lOmin，4°C)，移取400yL上清液于新2mL离心管中，弃沉淀。
[0075] (11)加入等体积(400μυ的氯仿：异戊醇（24:1)进行抽提，轻柔地上下颠倒混匀， 静置3min。
[0076] (12)离心（12000印111，5111；[11，4°0，吸取上清于新21111^离心管中。
[0077] (13)加入40yL (1 /10体积)冰预冷的NaAc (3M)以及880yL(2倍体积）的预冷的无水 乙醇，上下倒匀后置于-20°C冷冻30min。
[0078] (14)离心（12000印111，1〇111；[11，4。0，去上清。
[0079] (15)加入400yL预冷的7 5 %的乙醇洗涤。
[0080] (16)离心（12000印111，101^11，4。(：），去上清，并使乙醇挥发干净。
[0081 ] (17)加入40yL TE溶解沉淀。
[0082] (18)加入RNaseA(终浓度为50yg/mL)，37°C水浴lh。
[0083] (19)-2(TC 保存备用。
[0084] 1 · 2 · 1 · 2琼脂糖凝胶电泳
[0085] (1)制胶：
[0086] 称取0.25g琼脂糖放入150mL三角瓶中，加入25mL 1XTAE在微波炉中中火加热溶 解成凝胶溶液。安装好电泳模具和样品梳，取少量凝胶溶液将电泳模具两端封死，加入2yL DNA染色物质GoldView染料，混匀后倒入模具，注意不可产生气泡。
[0087] (2)上样电泳：
[0088]在电泳槽中盛放1 XTAE电泳buffer。待胶凝固后将电泳模具放入电泳槽中，然后 小心取出样品梳。分别取样品加入6 X 1 oading buf f er混勾后上样，正确连接电极，琼脂糖 凝胶的点样孔靠近负极，在5V/cm恒压条件下进行电泳，20min后停止电泳，将凝胶放入凝胶 成像系统进行成像、分析。
[0089] 1.2.2AIP3基因的扩增
[0090] 上游引物：TTCGAATTCATGGCAGCCAAGATCAAGAGC EcoR I 3.%~
[0091] 下游引物：CGCGCGGCCGCTGCCAGCTCCTTTCCGG Not I 63.5Γ
[0092] 表1PCR反应体系
[0095] 用移液枪混匀反应液，稍离心，盖紧盖子，在管盖上用记号笔做好标记后，按照表2 所示程序于PCR仪上进行扩增。
[0093]
[0094]
[0096] 表2PCR反应程序
[0097]
[0098] PCR反应结束后采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。取5yL PCR产物与lyL 6 X Loading buffer混勾，点入琼脂糖凝胶上样孔中，以DNA Marker(DL2000)为对照，在DNA 水平电泳槽中5V/cm恒压电泳30min。电泳结束后将凝胶放入凝胶成像系统进行成像、分析。
[0099] 1.2.3PCR产物的纯化
[0100] 采用北京赛百盛基因技术有限公司的PCR产物纯化试剂盒，对PCR产物进行纯化， 具体步骤如下：
[0101] (1)将无石蜡油的PCR反应产物在1 %的普通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的DNA条 带装入2mL离心管中。尽量切掉不含DNA的琼脂糖凝胶。
[0102] (2)200~400mg琼脂糖凝胶中加入0.4mL纯化树脂(使用前充分混匀），70°C保温5 ~1 Omin，每2min颠倒混勾1次，使琼脂糖凝胶完全融化。
[0103] (3)将混合液转移入离心纯化柱，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
[0104] (4)加入500yL 80%乙醇，13000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
[0105] (5)重复上一步，此步骤13000rpm离心2min，将乙醇除尽。
[0106] (6)将离心纯化柱套入干净的1.5mL或2mL离心管中，开盖放置2~3min，务必使乙 醇充分挥发干净。加入30yL ddH2〇于纯化树脂上。放置2min后，13000rpm离心30s。
[0107] (7)离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取1 yL电泳检测。-20 °C保存备用。1.2.4 目的片段及载体的酶切处理
[0108] 目的片段回收后，进行目的片段及载体的酶切，参照表3配制酶切体系，两个酶切 体系置于37°C保温1.5h。
[0109] 表3酶切体系
[0110]
[0111] 1.2.5目的基因与载体PG