EX-4T-1的连接
[0112] 参照方法2.2.3,将酶切后的片段和载体回收，回收产物按照按表4配制连接反应 体系，22°C连接30min。
[0113] 表4连接反应体系
[0114]
[0115] 1.2.6转化
[0116] 1.2.6.1感受态细胞的制备
[0117]取大肠杆菌DH5a制备感受态细胞，具体方法如下：
[0118] (1)取_70°C冻存的大肠杆菌DH5a划线接种于无抗性LB平板，于37°C培养过夜。
[0119] (2)挑取生长良好的单菌落接种于5mL LB液体培养基中，置于37°C摇床180rpm振 荡培养过夜。
[0120] (3)按1 %的接种量将活化培养过夜的菌液，转接至含100mL LB液体培养基的三角 瓶(500mL)中，37°C摇床180rpm振荡培养至0D6QQ为0.4~0.6。
[0121] (4)将三角瓶置于冰水中静置lOmin后，离心(5000印111，101^11，4°(：)，弃上清。
[0122] (5)加入50mL冰预冷的0.1M CaCl2,用移液器将菌体轻轻吹散，然后冰浴lOmin。
[0123] (6)离心（5000rpm，lOmin，4°C)，弃上清，加入25mL冰预冷的0 · 1M CaCl2，用移液器 将菌体轻轻吹散，冰水浴lOmin。
[0124] (7)离心（5000rpm，10min，4°C )，弃上清，加入2mL冰预冷的0 · 1M CaCl2，加已灭菌 的甘油至终浓度为10%，用移液器轻轻混匀，每管200yL分装。
[0125] (8)-7(TC 冻存备用。
[0126] 1.2.6.2将连接产物转化入感受态细胞
[0127] 将连接产物转化到DH5a大肠杆菌细胞中。具体步骤如下：
[0128] (1)制备 LB/Amp 板。
[0129] (2)取200yL感受态细胞置于冰水中浴冷。
[0130] (3)向感受态细胞悬液中加入5yL连接产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰 洛中静置30min。
[0131] (4)将离心管置于42°C水浴热激90s，然后迅速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷 却2min，该过程不要摇动离心管。
[0132] (5)向每个离心管中加入lmL 37°C预热的无菌LB培养基(不含抗生素），混匀后置 于37°C摇床150rpm振荡培养40min。
[0133] (6)将离心管内容物混匀，吸取500yL已转化的感受态细胞，加到LB/Amp琼脂平板 培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀。将平板置于室温直至液体被吸收，37 °C培养箱中倒置培 养12~16h〇
[0134] 1.2.7阳性克隆子的验证
[0135] 1.2.7.1 菌落 PCR 验证
[0136] 用牙签从平板培养基上挑选单菌落进行菌落PCR验证(菌落PCR体系和PCR程序分 别见表5与表6)，并把牙签放入至5mL含有终浓度为100yg/mL Amp的LB液体培养基中，37°C 摇床180rpm振荡培养12h。
[0137] 表5菌落PCR反应体系
[0138]
[0139] 表6菌落PCR反应程序
[0140]
[0141] 1.2.7.2重组质粒的提取
[0142] 取菌落PCR验证为阳性的对应菌液，采用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取重 组质粒DNA。具体方法如下：
[0143] (1)取1~4mL的过夜培养菌液，lOOOOg离心lmin，尽量吸尽上清。
[0144] (2)加入250yL无色溶液RB(含RNase A)，震荡悬浮菌体沉淀，不应留有小的菌块。
[0145] (3)加入250yL蓝色溶液LB，温和地上下翻转混合4~6次，使菌体充分裂解，形成蓝 色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5min)。
[0146] (4)加入350yL黄色溶液NB，轻轻混合5~6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合 均匀，中和完全），直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。
[0147] (5)15000g离心5min，小心吸取上清加入吸附柱中。
[0148] (6)15000g 离心lmin，弃流出液。
[0149] (7)加入650yL溶液WB，15000g离心lmin，弃流出液。
[0150] (8)15000g离心1~2min，彻底去除残留的WB。
[0151] (9)将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30yL EB或ddH20后，室温静 置lmin〇
[0152 ] (10) 1000g离心lmin，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20 °C保存。
[0153] 1.2.7.3双酶切重组质粒鉴定插入片段大小
[0154] 选用重组质粒多克隆位点两侧的酶切位点EcoR I和Not I对质粒进行双酶切，验 证目的片段大小。酶切反应体系按表7配制。酶切反应的条件:37°C，4h。
[0156]
[0155] 表7酶切反应体系
[0157]
[0158] 采用1%琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切的效果，电泳结束后将凝胶放入凝胶成像 系统成像、分析。
[0159] 1.2.7.4测序验证与分析
[0160] 将初步筛选为阳性的菌株测序，验证正确后，命名该重组质粒为pGEX-4T-Aip3，命 名该重组大肠杆菌为E.coli DH5apGEX-4T-Aip3。
[0161] 实施例2(长双歧杆菌黏附蛋白的诱导表达和纯化）
[0162] 第一步:长双歧杆菌黏附蛋白的诱导表达
[0163] 取实施例1制备的长双歧杆菌黏附蛋白表达菌株E.coli DH5apGEX-4T-Aip3用 IPTG进行诱导表达，具体步骤如下：
[0164] (1)挑取已平板划线培养的菌株单菌落，接种至3ml LB液体培养基中，并在试管中 加入Amp至终浓度为100μg/ml，于37°C恒温培养振荡器180r/m培养8h。
[0165] (2)按1 %的接种量转接至20ml低盐LB液体培养基，加入Amp至终浓度为100μg/ml， 于37 °C丨旦温培养振荡器180r/m培养。
[0166] (3)待菌体密度0D600nm = 0.6-0.9时，加入诱导剂IPTG至终浓度为ImM，于37°C恒 温培养振荡器180r/m诱导培养4_5h。
[0167] (4)诱导培养后将菌液等量转移至两支50ml离心管，4°C，5000r/m离心8min，弃上 清。分别加入lOmlPBS缓冲液重悬洗涤菌体沉淀，5000r/m离心8min，弃上清，10ml菌液离心 所得菌体中加入3ml PBS缓冲液重悬，冰浴超声（180W，工作3s，间隙5s)破碎20-30次，至菌 液澄清透明即可。
[0168] (5)所得溶液按lmL/管分装，-20 °C保存备用。
[0169] 第二步:SDS_PAGE检测表达蛋白
[0170] 采用SDS-PAGE凝胶电泳检测黏附蛋白的诱导表达情况，具体步骤如下：
[0171] (1)分别取第一步中所得样品各10(^1，4°(：，1300(^/111离心51^11，分别取5以1上清液 加入等量的2XSDS凝胶上样缓冲液，混匀备用。
[0172] (2)将样品于100°C沸水浴中煮6min后上样，按80V，25-35min+140V，l-1.5h电泳。
[0173] (3)电泳完毕后，取凝胶置于SDS凝胶染色液中，室温水平摇床摇动染色4_6h。
[0174] (4)回收染色液，用蒸馏水冲洗凝胶后，加入适量脱色液，室温摇床晃动脱色6_8h， 其间更换脱色液2-3次。观察分析电泳结果。
[0175] 第三步:双歧杆菌黏附蛋白的亲和纯化
[0176] 采用GST亲和层析柱纯化目的蛋白，步骤如下：
[0177] (1)谷胱甘肽树脂预装柱的平衡:使用30ml的缓冲液A(PBS+2mMEDTA)进行层析柱 平衡，控制流速为3mL/min左右。
[0178] (2)融合蛋白与层析柱的结合:将澄清的细胞粗提物上样，控制流速为l-2mL/min 左右。
[0179] (3)融合蛋白的洗脱:待曲线下降平稳后用缓冲液B (roS+2mMEDTA+20mM谷胱甘肽） 将目的蛋白洗脱，控制流速为lml/min，收集洗脱峰。
[0180] (4)浓缩蛋白：用超滤管浓缩洗脱液，过脱盐柱，纯水洗脱，控制流速为3mL/min，取 洗脱峰溶液，真空冷冻干燥后，取部分溶解进行SDS-PAGE电泳鉴定。鉴定结果如图1所示。
[0181] 实施例2(-种氨基酸序列为SEQ ID NO: 1的蛋白质制备方法）
[0182] 1)取重组大肠杆菌E.coli DH5apGEX-4T-Aip3培养，至培养液0D600nm为0.6时加 入诱导剂IPTG至终浓度为0.8mM，而后于35°C、震荡条件下诱导培养4h;
[0183] 2)收集菌体，将菌体重悬于PBS缓冲液后，在冰浴条件下超声破碎