器注入到细管中，上端注入60yL去离子水隔绝空气，静置，待凝胶完全聚合之后(5小时以上)，吸去凝胶柱顶部的去离子水，去掉底部的封口膜，并将玻璃管安装在电泳漕上，连接上电泳仪。取500yg蛋白样品经裂解液(溶剂为去离子水，溶质及浓度如下:7M尿素、2M硫脲、40g/LCHAPS和体积百分比2 %的Pharmalyte pH3_10)溶解并振荡，12000g离心后，上清液加于凝胶上端。样品端(上端)加上阴极电泳缓冲液(20mMNaOH)，另一端(下端)加上阳极电泳缓冲液(6.67mM H3PO4)。依次在电压200V电泳30分钟，电压400V电泳15小时，电压800V电泳I小时。
[0084]2、胶条平衡
[0085]一向电泳结束后，胶条移入4mL SDS上样缓冲液(溶剂为pH = 6.8 62.5mM Tris-HCl缓冲而已，溶质及浓度如下:体积百分比10%甘油、25g/L SDS、10g/L 二硫苏糖醇和
0.lg/L溴酚蓝)中平衡30分钟。
[0086]3、第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0087]⑴制胶
[0088]先在灌胶模具中灌入聚丙烯酰胺质量百分含量为15%的分离胶，静置直至分离胶凝固，接着灌入聚丙烯酰胺质量百分含量为4%的浓缩胶，得到垂直胶板，位于垂直胶板上部的浓缩胶的高度为2cm，位于垂直胶板下部的分离胶的高度13cm。
[0089](2)电泳
[0090]将步骤2平衡好的胶条转移到步骤(I)制备好的垂直板胶的顶端，用I%(Ig/100ml)的琼脂糖溶液(溶剂为去离子水)密封，置于电泳槽上，加满电极缓冲液，在电流为4mA的条件下预电泳20分钟，在电流为30mA的条件下电泳约3小时。
[0091]其中，所述电极缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下:质量百分含量为0.3%的Tris、质量百分含量为1.44%的甘氨酸、质量百分含量为0.1 %的SDS。
[0092]4、电泳凝胶染色
[0093]第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳完成后，取下凝胶，放入到含有10ml的固定液的染色盒中，然后放在转速为60次/分钟的摇床上摇动30分钟后，将凝胶放入90°C10ml的染色液中，在60次/分钟的摇床上摇动10分钟后;将凝胶放入10ml的脱色液中，在60次/分钟的摇床上摇动30分钟，重复3次，得到蛋白点鲜明考马斯亮蓝染色后的凝胶。
[0094]其中，所述固定液的组成如下:质量百分含量为40%的乙醇、质量百分含量为10%的冰乙酸，余量为水。所述染色液的组成如下:质量百分含量为0.02%的考马斯亮蓝R-350、质量百分含量为10%的冰乙酸，余量为水。所述脱色液的组成如下:质量百分含量为10%的冰乙酸，余量为水。
[0095]5、凝胶扫描及图像分析
[0096]将经步骤4考马斯亮蓝染色后的凝胶用UMAX扫描仪在参数为256阶灰度、600dpi条件下透射扫描，所得图像用ImageMaster? 2D Platinum软件(Amersham B1science)进行分析。
[OO97 ] 结果显示:未经PEG沉淀去除RuB i s c ο蛋白的构树叶片蛋白质(对照组)的双向电泳图谱如图1所示;经PEG沉淀去除RuBisco蛋白的构树叶片蛋白质(实验组)的双向电泳图谱如图2所示。图1、2中A、B、C部分详细情况如图3所示。图1和图2中A部分为RuBisco蛋白大亚基(LSU)，B、C、部分为低丰度蛋白质。可见与对照组相比，实验组去除了RuBisc0蛋白后，胶图RuBisc0蛋白点大小显著降低，低丰度蛋白分离效果显著提升。图3为图1和图2中A、B、C部分放大显示后的双向电泳图谱。对A、B、C三个部分蛋白数目进行统计，去除RuBisCO蛋白后，A、B部分有更多蛋白被检测出来，C部分蛋白的分离效果明显提升。
【主权项】
1.一种去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法，是利用浓度为300-500g/L的PEG4000溶液去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: (1)将植物叶片放入GMI匀浆液中研磨后得到第一匀浆，将GM Π匀浆液加入到所述第一匀浆中研磨后得到第二匀浆； 所述GM I匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度为:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ； 所述GM Π匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度为:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和体积百分含量为3-5% 的Nonidet P-40； (2)将所述第二匀浆于4°C8000-12000g离心5min-15min，取上清，记为第一上清液； (3)向所述第一上清液中加入等体积的浓度为300-500g/L的PEG4000溶液，冰上静置20min-40min，于 4 °C 8000-12000g 离心 5min_l 5min，取上清，记为第二上清液； (4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4体积的浓度为400-600g/L的三氯乙酸溶液，冰上静置30min-50min，于4°C8000_12000g离心5min_15min，弃上清，得蛋白粗沉淀； (5)向所述蛋白粗沉淀中加入4°C预冷的溶液A，于4°C8000-12000g离心5min-15min，弃上清，得沉淀，完成一次洗涤;重复所述洗涤的步骤至少一次，最后一次所得沉淀即为去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白； 所述溶液A的溶剂为丙酮，溶质及浓度为10g/L的二硫苏糖醇。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述植物叶片、所述GMI匀浆液与所述GM Π匀浆液的使用配比为0.5g: 500-700yL:500-700yL;或步骤(I)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比为0.5g:1000-2000yL;或 步骤(I)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸溶液的使用配比为0.5g: 400-600μL;或 步骤(5)中，进行所述洗涤时，所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比为1: (3-5)。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述植物叶片、所述GMI匀浆液与所述GM Π匀浆液的使用配比为0.5g: 600yL: 600yL；或 步骤(I)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比为0.5g: 1500yL;或 步骤(I)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸溶液的使用配比为0.5g: 500yL;或 步骤(5)中，进行所述洗涤时，所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比为1:4。5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述GMI匀浆液的溶剂为pH值为8的500mM Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度为:20mM MgCl2和ImM PMSFjP/^ 所述GM Π匀浆液的溶剂为pH值为8的500mM Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度为:20mMMgCl2、ImM PMSF和体积百分含量为4%的Nonidet P-40。6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于:步骤(2)-步骤(5)中，所述离心均为 4°C 1000g 离心 lOmin。7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述冰上静置的时间为30min;或 步骤(4)中，所述冰上静置的时间为40min;或 步骤(5)中，共进行所述洗涤2次。8.—种用于去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的成套产品，含有如下: (al)GM I匀浆液; 所述GM I匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度为:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ； (a2)GM Π匀浆液; 所述GM Π匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液，溶质及浓度为:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和体积百分含量为3-5% 的Nonidet P-40； (a3)浓度为 300-500g/L 的 PEG4000 溶液； (a4)浓度为400-600g/L的三氯乙酸溶液； (&5)溶液八； 所述溶液A的溶剂为丙酮，溶质及浓度为10g/L的二硫苏糖醇。9.权利要求1-7中任一所述方法或权利要求8所述的成套产品在分离植物叶片蛋白质中的应用。10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或成套产品或应用，其特征在于:所述植物为构树。
【专利摘要】本发明公开了一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。本发明所提供的方法可用于去除所有叶片蛋白质中RuBisco蛋白，包括如下步骤：(1)制备匀浆；(2)匀浆离心；(3)第一上清液离心；(4)第二上清液离心；(5)蛋白粗沉淀的洗涤。用本发明的方法提取植物叶片蛋白，有利于减少高丰度蛋白RuBisco干扰、提高2-DE电泳分辨率，为优化植物叶片蛋白质组检测，运用生物技术手段进一步改良品种打下基础。
【IPC分类】C07K1/30
【公开号】CN105646645
【申请号】
【发明人】沈世华, 王小曼, 邳植, 藤林宏, 彭献军
【申请人】中国科学院植物研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月23日