一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法
【技术领域】
[000?]本发明属于蛋白质分离检测领域,涉及一种去除构树叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]构树是一种多功能综合性树种,整个植株都具有开发潜力。其叶片含有丰富的粗蛋白、粗脂肪和粗纤维等营养成分,可以部分替代豆柏、麦麸等常规饲料,用于猪、牛、羊等家畜养殖。在我国饲料行业的配方技术结构仍以玉米-豆柏型为主。豆柏、玉米等大宗原料对外依存度越来越高,受国际市场影响愈来愈大。因此,如何突破现有的配方技术,开发新的原料和替代品,成为增强企业综合实力,提高竞争力的重要挑战。构树叶片正是解决这一问题的关键。2015年构树扶贫以列为国务院十大精准扶贫项目之一。
[0003]双向凝胶电泳技术作为研究植物蛋白质组的重要手段,为生物技术手段进行品种改良提供重要理论依据。在双向凝胶电泳技术(2-DE)中,RuBisco这种超高丰度的蛋白会严重限制低丰度蛋白的检测。主要有三方面的影响:一方面蛋白上样量有限,低丰度蛋白因为含量太少在后续的染色过程中不能显现;另一方面是RuBisco的位置效应,RuBisco蛋白会掩盖周围的低丰度蛋白;第三是在双向上整体干扰其它蛋白的正常电泳分离,其周围蛋白点的泳道变化最为明显。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法。
[0005]本发明所提供的去除植物叶片蛋白质中RuBisc0蛋白的方法,是利用浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白。
[0006]进一步,所述去除植物叶片蛋白质中RuBisco蛋白的方法,可包括如下步骤:
[0007](I)将植物叶片放入GMI匀浆液中研磨后得到第一匀浆,将GMII匀浆液加入到所述第一匀浆中研磨后得到第二匀浆;
[0008]所述GMI匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液,溶质及浓度为:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF ;
[0009]所述GMII匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液,溶质及浓度为:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和3-5% (体积百分含量)Nonidet P-40;
[0010]其中,pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液为本领域常规表示方法,指400-600mM Tris溶液用HCl调pH至7-9的缓冲液。
[0011](2)将所述第二匀浆于4°C8000-12000g离心5min-15min,取上清,记为第一上清液;
[0012](3)向所述第一上清液中加入等体积的浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶剂为去离子水),冰上静置20min-40min,于4°C8000-12000g离心5min_15min,取上清,记为第二上清液;
[0013](4)向所述第二上清液中加入所述第二上清液1/4体积的浓度为400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶剂为去离子水),冰上静置30min-50min,于4°C8000-12000g离心5min-15min,弃上清,得蛋白粗沉淀;
[0014](5)向所述蛋白粗沉淀中加入4°C预冷的溶液A,于4°C8000-12000g离心5min-15min,弃上清,得沉淀,完成一次洗涤;重复所述洗涤的步骤至少一次,最后一次所得沉淀即为去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白;
[0015]所述溶液A的溶剂为丙酮,溶质及浓度为10g/L二硫苏糖醇(DTT)。
[0016]在所述方法的步骤(I)中,所述植物叶片、所述GMI匀浆液与所述GMII匀浆液的使用配比可为0.58:500-70(^1^500-70(^1^步骤(1)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比可为0.5g: 1000-2000yL。步骤(I)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比可为0.5g: 400-600yL。步骤(5)中,进行所述洗涤时,所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比可为I:(3-5)。
[0017]进一步,在所述方法的步骤(I)中,所述植物叶片、所述GMI勾楽液与所述GMn勾楽液的使用配比具体为0.5 g: 6 O O μ L: 6 O O μ L。步骤(I)中所述植物叶片与步骤(3)中所述PEG4000溶液的使用配比具体为0.5g: 1500yL。步骤(I)中所述植物叶片与步骤(4)中所述三氯乙酸(TCA)溶液的使用配比具体为0.5g:500yL。步骤(5)中,进行所述洗涤时,所述蛋白粗沉淀与所述溶液A的体积配比具体为1:4。
[0018]在本发明中,所述GMI匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液,溶质及浓度具体为:20mM MgCl2和ImM PMSF。所述GMII匀浆液的溶剂为pH值为8的500mM Tris-HCl缓冲液,溶质及浓度具体为:20mM MgCl2、lmM PMSF和4% (体积百分含量)Nonidet P-40。
[0019]在所述方法的步骤(2)-步骤(5)中,所述离心均具体为4°C1000g离心lOmin。
[0020]在所述方法的步骤(3)中,所述冰上静置的时间具体为30min。步骤(4)中,所述冰上静置的时间具体为40min。
[0021]在本发明的一个实施例中,步骤(5)中,共进行所述洗涤2次。
[0022]本发明的第二个目的是提供一种用于去除植物叶片蛋白质中RuBisc0蛋白的成套
τ?: 口广PR ο
[0023]本发明所提供的用于去除植物叶片蛋白质中RuBisc0蛋白的成套产品,含有如下:
[0024](al)GMI 匀浆液;
[0025]所述GMI匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液(用去离子水配制),溶质及浓度为:15-25mM MgCl2和0.8-1.2mM PMSF;
[0026]在本发明中,所述GMI匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液(用去离子水配制),溶质及浓度具体为:20mM MgCl2和ImM PMSF。
[0027](a2)GMII 匀浆液;
[0028]所述GMII匀浆液的溶剂为pH值为7-9的400-600mM Tris-HCl缓冲液(用去离子水配制),溶质及浓度为:15-25mM MgCl2、0.8-1.2mM PMSF和3-5% (体积百分含量)NonidetP-40;
[0029]在本发明中,所述GMII匀浆液的溶剂为pH值为8的500mMTris-HCl缓冲液(用去离子水配制),溶质及浓度具体为:20mM MgCl2UmM PMSF和4% (体积百分含量)Nonidet P-40 ο
[0030](a3)浓度为300-500g/L(如400g/L)的PEG4000溶液(溶剂可为水);
[0031](a4)浓度为400-600g/L(如500g/L)的三氯乙酸(TCA)溶液(溶剂可为水);
[0032](&5)溶液八;
[0033]所述溶液A的溶剂为丙酮,溶质及浓度为10g/L二硫苏糖醇(DTT)。
[0034]所述方法或所述成套产品在分离植物叶片蛋白质中的应用也属于本发明的保护范围。
[0035]在所述应用中,具体是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离的。所述采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离的方法可包括如下步骤:
[0036](a)将步骤(5)所得沉淀(即采用上述去除植物叶片蛋白质中RuBisc0蛋白的方法获得的去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白)进行第一向等电聚焦电泳;
[0037](b)待步骤(a)的第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条,进行胶条平衡;
[0038](c)将经步骤(b)平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳;
[0039](d)待步骤(C)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶,进行考马斯亮蓝染色,对染色结果进行扫描及图像分析,完成植物叶片蛋白质的分离。
[0040]在所述方法的步骤(a)中,进行所述第一向等电聚焦电泳的方法可包括如下步骤:将步骤(5)所得沉淀(即采用上述去除植物叶片蛋白质中RuBisc0蛋白的方法获得的去除了RuBisco蛋白的植物叶片蛋白)经裂解液(溶剂为去离子水,溶质及浓度如下:7M尿素、2M硫脲、40g/L CHAPS和体积百分比2%的Pharmalyte pH3_10)溶解,12000g离心后,取上清液按照如下条件进行等电聚焦电泳:电压200V电泳30分钟,电压400V电泳15小时,电压800V电泳I小时。
[0041]在所述方法的步骤(b)中,进行所述胶条平衡的方法具体可包括如下步骤:将所述胶条移入SDS上样缓冲液(溶剂为pH6.8的62.5mM Tris-HCl缓冲液,溶质及浓度如下:体积百分比10%甘油、25g/L SDS、10g/L二硫苏糖醇和0.1g/L溴酚蓝)中平衡30分钟。
[0042]在所述