（4)达到目的浓度所需原液的量，计算如下:达到目的浓度所需原液的量=目的量/ 稀释倍数。本实验计算如下：达到目的浓度所需原液的量= 40mL/13.425 = 2.98mL。即取 26 · 85 X 106cells/mL的细胞原液2 · 98mL放入灭菌的50mL离心管内，然后加入37 · 02mL(40-2.98)含15%胎牛血清的€1-|^培养液即可配成2\10606118/1^的细胞悬液401^，然后加入 la，25(0H)2D3储存液40yL，操作过程应避光，即la，25(0H)2D 3终浓度为1X10-8M;再加入4yL soluble RANKL储存液，即soluble RANKL终浓度为20ng/mL;加液过程在超净工作台上操 作，至此，所需2 X 106cel ls/mL的细胞悬液目的量配置完成。
[0062] 1.3培养细胞、加药
[0063]配制巴氯芬储存液（lmg/mL)、化合物（I)储存液（lmg/mL)、巴氯芬与化合物（I)组 合物储存液(〇. 5mg/mL巴氯芬+0.5yg/mL化合物（I))。DMS0超声溶解。
[0064] (1)细胞接种：取4行6列24孔培养板一块，每孔加入2X106cell S/mL的细胞悬液 0.5mL(l X 106cells)。（2)加药:取巴氯芬储存液一支于培养板的第2列分别加入2.5yL，每 加一孔均需换一个吸头;取化合物（I)储存液一支于培养板的第3列分别加入2.5yL，每加一 孔均需换一个吸头；取巴氯芬与化合物（I)组合物储存液一支于培养板的第4列分别加入 2.5yL，每加一孔均需换一个吸头。至此，第一列为对照组，第二列为巴氯芬组，第三列为化 合物（I)组，第四列为巴氯芬与化合物（I)组合物组。巴氯芬组和化合物（I)组每孔药物浓度 为5yg/mL;巴氯芬与化合物（I)组合物组每孔含巴氯芬2.5yg/mL和化合物（I) 2.5yg/mL。加 完后剩余药液放入4°C恒温冰箱保存。第一列不加药物，作为对照组。（3)培养细胞:加完药 后，将培养板放入C0 2培养箱内，在37°C、5 %C02及饱和湿度条件下，培养7天。培养至第4天时 换培养液一次，配制含有15%胎牛血清的a-MEM培养液40ml(6mL胎牛血清加入34mLa-MEM培 养液中），内含l〇yL青霉素8yL链霉素(80万u青霉素，100万链霉素分别用2mL灭菌蒸馏水溶 解），加入4yL soluble RANKL储存液，然后取la，25(0H)2D3储存液40yL加入。从培养箱内取 出培养板后，倒置显微镜下观察细胞生长状况，每孔吸出旧培养液300yL，加入新培养液400 yL，每吸出一列更换一次吸头，每加一孔更换一次吸头。换液完成后，将培养板继续放入C02 培养箱内，在37 °C、5 % C02及饱和湿度条件下，再培养3天。
[0065] 2、破骨前驱细胞(P0C)培养
[0066] 2.1全骨髓细胞的提取:如同以上所述方法，制备全骨髓细胞悬液1.5mL。
[0067] 2.2非附着骨髓细胞的提取
[0068] (1)把用培养液冲洗过的凝胶柱，固定在固定架上；（2)缓慢向凝胶柱内注入全骨 髓细胞1.5mL，打开三通，缓慢过滤；待1.5mL全骨髓细胞渗入凝胶柱内后，再缓慢注入含 15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液1 OmL。（ 3)收集含有非附着骨髓细胞的培养液共计12~15mL， 此液称为非附着骨髓细胞原液。
[0069] 2.3细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数)及达到目的浓度
[0070] 所需原液的量如同以上所述方法，计算细胞数，稀释倍数，达到目的浓度所需原液 的量。本实验计算细胞数为337个，推算细胞原液的浓度为16.85X 106cellS/ml;稀释倍数 为8.425，即细胞原液需稀释8.425倍才能达到需要的目的浓(2乂10 6〇6118/1111);达到目的 浓度所需原液的量40ml/8.425 = 4.75ml，即取4.75ml细胞原液放入灭菌的50ml离心管内， 然后加入35.251111(40-4.75)含15%胎牛血清的€[-|^1培养液即可配成2\10 (^118/1111的目 的细胞悬液40ml，然后加入la，25(0H)2D3储存液40ul，操作过程应避光，即la，25(0H) 2D3终 浓度为1 X 10-8M;加入soluble RANKL储存液4ul，即soluble RANKL终浓度为20ng/ml;加液 过程均在超净工作台上操作，至此，未附着骨髓细胞悬液目的量配置完成。
[0071] 2.4细胞培养及加药同1.3。
[0072] 3、倒置显微镜下观察
[0073] 3.1TRAP 染色
[0074] (1)培养7天后，将培养板从培养箱内取出，弃去培养液；（2)加入固定液0.4mL/孔， 固定1分钟；（3)弃去固定液，蒸馏水冲洗四次；（4)加入染色液3-4滴/孔，用锡纸包裹培养 板；（5)在37°C、5 % C02及饱和湿度条件下孵育30分钟后，取出培养板，弃去染色液，蒸馏水 冲洗四次，自然干燥。
[0075] 3.2光镜观察
[0076]带染色液倒置显微镜下观察后，弃去染色液，蒸馏水洗4次，自然干燥，普通光镜下 观察计算破骨细胞数。
[0077] 4、统计学分析
[0078] 使用SPSS19.0统计学软件进行分析。数据处理采用mean土SD表示。
[0079]三、结果及结论
[0080]在全骨髓细胞培养系中，与对照组比较，巴氯芬与化合物（I)组合物组TRAP染色阳 性细胞(3核以上)数显著减少，比巴氯芬组、化合物（I)组减少更为显著，说明巴氯芬与化合 物（I)组合物对破骨细胞的形成有显著的抑制作用，且强于巴氯芬或化合物（I)单独的抑制 作用。结果见表1。
[0081 ]在破骨前驱细胞培养系中，与对照组比较，巴氯芬与化合物（I)组合物组TRAP染色 阳性细胞(单核或2核)数显著减少，比巴氯芬组、化合物（I)组减少更为显著，说明巴氯芬与 化合物（I)组合物对破骨前驱细胞的形成有显著的抑制作用，且强于巴氯芬或化合物（I)单 独的抑制作用。结果见表2。
[0082]表1全骨髓细胞培养系中TRAP染色阳性细胞(3核以上)数 「mini
[0084] 表2破骨前驱细胞培养系中TRAP染色阳性细胞(单核或2核)数
[0085]
[0086] 实验结果表明，巴氯芬与化合物（I)组合物对破骨细胞的分化及增殖具有抑制作 用，且强于巴氯芬或化合物（I)单独的抑制作用。应用巴氯芬与化合物（I)组合物治疗以破 骨细胞活性增强为主的骨破坏性疾病有可能成为一种有前景的治疗方法。
[0087] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种己氯芬的药物组合物，其特征在于:包括己氯芬、如权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可W接受的载体。3. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含W下操作步骤：（a)将地 愉的干燥根粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、 乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取 物；（b)步骤(a)中正下醇萃取物用大孔树脂除杂，先用8%乙醇洗脱6个柱体积，再用70%乙 醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中70% 乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烧-甲醇 梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤k)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、 5:1和2:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键 合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗 脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。4. 根据权利要求3所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:步骤(a)用75%乙醇热回 流提取，合并提取液。5. 根据权利要求3所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为AB-8型 大孔吸附树脂。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗骨破坏性疾病的药物中的应用。7. 权利要求2所述的己氯芬的药物组合物在制备治疗骨破坏性疾病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种巴氯芬的药物组合物及其在骨破坏性疾病中的应用，本发明提供的巴氯芬的药物组合物中含有巴氯芬和一种从地榆的干燥根中分离得到的结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，巴氯芬和该天然产物化合物(Ⅰ)单独作用时，对骨破坏性疾病的治疗效果较弱；二者联合作用时，对骨破坏性疾病的治疗效果显著提高，可以开发成治疗骨破坏性疾病的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【IPC分类】A61K31/195, A61K36/739, A61P19/08, A61K31/585, C07J73/00
【公开号】CN105646642
【申请号】
【发明人】不公告发明人
【申请人】钱浩
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月23日