-C)，21.7(CH3,27-C)，18 · 6(CH3，28-C)，20 ·4(CH3，30-C)。IR谱图中的 1725cm-1 与 1694cm-1 吸收带表明该化合物 结构中存在羰基与共辄羰基;UV谱图中的最大吸收207nm与245nm说明结构中存在共辄双 键。氢谱核磁数据表明该结构中不饱和度是由三个C-C双键结构，四个羰基结构以及五个环 状骨架组成。碳谱核磁数据与DEPT谱数据表明该化合物结构中含有32个碳，包含七个甲基 (3〇22.2、19.5、16.6、22.8、21.7、18.6与20.4)，六个亚甲基（3。38.1、28.5、32.6、47.5、36.5 与 119.6)，九个次甲基0。152.2、119.3、79.3、48.2、67.4、4〇.2、77.5、59.4、126.7与29.8)， 十个季碳（5。168.5、207.4、30.0、35.1、45.9、47.3、170.8、162.5、195.2与154.8)，其中两个 酮基（δ^207·4与195.〇)，两个酯羰基0。168.5与17〇.8)，两个连氧碳0。79.3与77.5)，六个 烯碳(δ[152.2与119.3、162.5与126.7; 154.8与119.6)。核磁数据表明该化合物含有一个甲 基侧链的 α，β_ 不饱和七元内酯环结构 WH5.97(d，J=12.7HZ，H-l)，5.84(d，J=12.7Hz，H- 2)，4.58(qd，J = 6.8,4.2Hz，H-4)，2.56(m，H-5)，1.67(3H，d，J = 6.8Hz，H-28);Sc152.2(CH， C-1)，119.3(CH，C-2)，168.3(C，C-3)，79.3(CH，C-4)，48.2(CH，C-5)，35.1(C，C-10)，18.6 (01 3,028)]，一个环丙烷结构[3[10.98((1，了 = 4.1取，!1-19)，1.99((1，了 = 4.1取，!1-19);3 030.0(<：，(：-9)，35.1((：，(：-10)，36.5(012，(：-19)]，一个乙酰氧基[3[12.07(8，!1-1613,3!1) ;5 。170.8(<：，(：-16&)，22.2(013，(：-1613)]。腿8(：谱中!1-160[15.33)与(：-16&(3。170.8)的相关性， 表明乙酰氧基与C-16相连。通过NOESY谱数据解析!1-40( 14.58)、16-28 0111.67)与!1-5(3 H2.56)关系可以说明Me-28的相对立体构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献 关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确 定，理论值与实验值基本一致。该化合物的化学结构及碳原子标号如下：
[0024]
[0025] 实施例2:对骨破坏性疾病的的治疗作用
[0026] -、材料和仪器
[0027] SD雄性大鼠（4周龄)购于南京大学动物实验中心，清洁级，体重150g。巴氯芬购自 中国药品生物制品检定所。化合物（I)按照实施例1方法自制，HPLC归一化纯度大于98%。1 a，25(0H)2D3购于英国普利茅斯生物研究实验室。α-ΜΕΜ培养基购于美国GIBCOBRLdoluble RANKL购于英国Peprotec Science。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒购于美国Sigma公 司。葡聚糖凝胶购于上海如吉科技发展有限公司。标准胎牛血清购于山东银香伟业生物有 限公司。注射用青霉素钠购于华北制药有限公司。注射用硫酸链霉素购于深圳华药南方制 药有限公司。丙酮、甲醛溶液购于石家庄市有机化工厂。异氟烷购于鲁南贝特制药有限公 司。二甲基亚砜购于天津市光复精细化工研究所。
[0028] BB5060/BB16二氧化碳培养箱上海(Heraeus公司），VD-650型桌上式细胞培养超净 操作台（苏州净化设备有限公司），BFX5-320型低速离心机（中国上海泸南科学仪器联营 厂），XD-1019810倒置显微镜(江南公司），CX-21光学显微镜（日本OLYMPUS)，微量加样器(法 国GILSON)，2510型变频振荡仪(上海新波生物技术有限公司），GF-300型电子天(Japan A&D Company，limited)，725型超低温冰箱（Forma Scientific · Inc)。
[0029] 药液的配制及葡聚糖凝胶柱的制备：
[0030] 1、α-ΜΕΜ培养液的制备
[0031] (Ι)α-ΜΕΜ粉一袋+超纯净水800ml，完全溶解；
[0032] (2)加碳酸氢钠3.02g待完全溶解后加盐酸测pH达7.2;
[0033] (3)再次加超纯净水至1000ml;
[0034] (4)加抗生素(青霉素及链霉素）；
[0035] (5)滤过灭菌(0.22微米微孔滤膜过滤，Pomp排气）；
[0036] (6)500ml灭菌瓶分装4°C储藏备用。
[0037] 2、la，25(0H)2D3 储存液的分装
[0038] (1)取la，25 (OH)2D3原液50微升（50微升一支），加入无水乙醇1150微升，使总量至 1200微升（8卩24倍稀释）；
[0039] (2)以100ul/只分装于12支灭菌试管内，-30°C冰箱内储存备用；
[0040] (3)应用前再次稀释1000倍，使最终浓度为IX 10_8M。
[0041 ] 3、Soluble RANKL储存液分装
[0042] (1)取1^疆17东干粉一支（10微克）；
[0043] (2)0.1Mtris-HCl bufferfO微升溶解；
[0044] (3)以5ul/只分装于10支灭菌冷冻管内，-30 °C冰箱内储存备用；
[0045] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培养液495微升稀释（即稀释100倍）；添 加前再次稀释100倍，使最终浓度为20ng/ml。
[0046] 4、TRAP (抗酒石酸酸性磷酸酶)固定液的制备
[0047]在染色之前，按产品说明书配制。首先取无菌20ml试管一支，按以下顺序依次加入 试剂:丙酮6.5ml，枸橡酸2.5ml，甲醛0.8ml，充分混勾，计9.8ml，现配现用。
[0048] 5、TRAP染色液的制备：同样是在染色之前配制，按产品说明制备。
[0049] 6、葡聚糖凝胶柱的制备
[0050] (1)消毒后50ml注射器一个，除去内芯；
[0051] (2)注射筒与注射头交接处置消毒后的脱脂棉球一个；
[0052] (3)固定架固定针筒，针头处接关闭状的三通；
[0053] (4)将灭菌的葡聚糖凝胶混匀，抽取30ml注入针筒内，打开三通，缓慢过滤沉淀，待 凝胶沉淀液面至15ml时为止;关闭三通，放入4°C恒温冰箱过夜；
[0054] (5)实验前1小时用含有15 %胎牛血清的a-MEM培养液50ml缓慢注入凝胶柱内，打 开三通，自然过滤洗涤凝胶柱后待用。
[0055]二、试验方法 [0056] 1、全骨髓细胞培养
[0057] 1.1全骨髓细胞提取
[0058]实验开始前30分钟将标准胎牛血清放入37 °C水浴箱内解冻;取50mL无菌离心管一 个，装入40mL不含胎牛血清的a-MEM培养液，以备冲洗全骨髓细胞用。
[0059] (1)选4周龄SD雄性大鼠1只，75%乙醇消毒后，采用异氟烷吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，无菌条件下取大鼠两侧胫骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用10mL注射器抽取 不含血清的a-MEM培养液，换用25号针头后自骨髓腔内冲出骨髓细胞至50mL无菌离心管内； (4)将所提取的细胞悬液充分吹打，待没有团块后，将盛有细胞的离心管与平衡管一起放入 离心机内离心，调整转速(2000转/分），离心5分钟;离心过程中配制含有15%胎牛血清的a-MEM培养液50mL(7.5mL胎牛血清加入42.5mLa-MEM培养液中）备用；（5)离心结束后弃去上清 液，加入含15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液20mL，充分吹打混匀，形成细胞悬液，此液简称为细 胞原液。
[0060] 1 · 2细胞数的计算(原液浓度及稀释倍数）
[00611 (1)取以上提取的细胞悬液25yL放入试管内，然后加入5%Acoh(醋酸)475yL，即形 成20倍稀释的细胞悬液;将试管放在振荡器上，振荡20秒钟，目的是去除红细胞；（2)计算细 胞数:取振荡后细胞悬液滴入细胞计数盘，勿超过边缘，盖玻片覆盖，倒置显微镜下计算细 胞数，计数盘4个大格内所有细胞均计入。本实验计算细胞数为537个，根据公式(细胞数/4) \20\10 406118/11^推算细胞原液的浓度，本实验计算如下（537/4)\20\ 104 = 26.85\ 106cellS/mL即本实验细胞原液浓度为26.85\10 6(^118/11^，而我们需要的目的浓度是2\ 106cell S/mL，所以细胞原液需要稀释。（3)稀释倍数计算如下:稀释倍数=原液浓度/目的 浓度;本实验稀释倍数=26.85 X 106cells/mL/2 X 106cells/mL= 13.425，即原液需要稀释 13.425倍才能达到需要的目的浓度。本实验需要2\10%118/1^的细胞悬液401!^，简称为 目的量。