-乙酸系统,甲醇:水:乙酸的体积比为10: 90:0.01,按出峰顺序收集洗脱液,共收集7个流分,分别命名为丽-121,丽-122,11-123,11-124,ΜΜ-125,ΜΜ-126,ΜΜ-127,备用;
[0088] S5.将步骤S4中收集到的流分ΜΜ-124用制备液相纯化,制备液相色谱柱为:YMC, 20mm*250mm,流速:5ml /min,流动相为甲醇-水-乙酸系统,甲醇:水:乙酸的体积比为15:85: 〇. 01,收集洗脱液,重结晶后得到所述苯丙素类化合物。
[0089]将实施例1至实施例5制备得到的化合物进行质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱 的检测,结果证明所得化合物为:4'_葡萄糖基(6"_葡萄糖基)-3'_甲氧基苯基3-羟基-4-甲 基戊酸甲酯。其结构式如式(I)所示:
[0090]
[0091] 其质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱的谱图数据如下:
[0092] HR-ES頂S显示[M+Na]+为m/z 601.2243,结合核磁特征,可得分子式为C25H38〇15,不 饱和度为7。
[0093] 4 匪R(400MHz,Me0D)S6.77((1, J = 2.3Hz,lH),6.70((1, J = 8.6Hz,lH),6.57((1, J =8.6Hz,2.3Hz,lH),5.47(s,lH),4.85(s,lH),4.67(t,lH),4.26(m,2H),3.20-4.00(glc-H),2.81(s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0094] 13C-NMR(150MHz,CD30D): 176 · 5(C-1),151·4(C-4,),147·9(C-1,),141·5(C-3,), 114.7(C-2,),112.7(C-6,),109.1(C-5,),102.3(C"),101.1(C",),88.4(C-3),60.5(C-2), 55.1(-0CH 3),37.7(C-4),24.8(C-5),20.2(-CH3),61.5-77.8(glc-C)。
[0095] 实施例6苯丙素类化合物盐的制备
[0096] 苯丙素类化合物盐酸盐的制备:
[0097]搅拌下将该化合物甲醇溶液中滴加饱和盐酸至pH值2-3,搅拌下滴加乙腈,抽滤, 干燥得到白色粉末固体,即为化合物的盐酸盐。
[0098]苯丙素类化合物磺酸盐的制备:
[0099] 在含有该苯丙素类化合物、溶剂、磺酸、中性油和促进剂的反应体系中加入碱金属 的氢氧化物,加入溶剂、低级醇和助促进剂,通入二氧化碳,分离得到白色粉末固体,即为化 合物的磺酸盐。
[0100] 苯丙素类化合物钾盐或钠盐的制备:
[0101] 将溶于乙醇中的Κ0Η或NaOH加入该化合物中,搅拌下加热回流反应,冷制室温,搅 拌下滴加乙腈,抽滤,干燥得白色固体,即为该化合物的钾盐或钠盐。
[0102] 苯丙素类化合物铵盐的制备:
[0103] 搅拌下将该化合物甲醇溶液中滴加饱和氨水至pH值9-11,搅拌下滴加乙腈,抽滤, 干燥得到白色固体,即为化合物的铵盐。
[0104] 上述苯丙素类化合物盐的谱图数据:
[0105] 苯丙素类化合物盐酸盐:ESIMS显示m/z 614.38,核磁特征1!1-匪1?(60(^取, 0)300):? NMR(400MHz,Me0D)S6.74((1, J = 2.3Hz,lH),6.67((1, J = 8.6Hz,lH),6.44((1, J = 8.6Hz,2.3Hz,lH),5.41(s,lH),4.80(s,lH),4.60(t,lH),4.21(m,2H),3.20-4.00(glc-H), 2.77(s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0106] 苯丙素类化合物磺酸盐:ESIMS显示为m/z 642.77,核磁特征咕-丽1?(6001〇^, 0)300):? NMR(400MHz,Me0D)S6.78((1, J = 2.3Hz,lH),6.72((1, J = 8.6Hz,lH),6.59((1, J = 8.6Hz,2.3Hz,lH),5.48(s,lH),4.89(s,lH),4.69(t,lH),4.28(m,2H),3.20-4.00(glc-H), 2.83(s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0107] 苯丙素类化合物钾盐或钠盐:
[0108] 钾盐ESIMS显示m/z616·17,核磁特征1H-NMR(600MHz,CD30D): 1H匪R(400MHz, Me0D)56.71(d ,J = 2.3Hz,lH) ,6.66(d ,J = 8.6Hz , 1H) ,6.54(d ,J = 8.6Hz , 2.3Hz , 1H), 5.44 (s,lH),4.81(s,lH),4.61(t,lH),4.26(m,2H),3.20-4.00(glc-H),2.80(s,lH),1.43,1.14 (s,6H)〇
[0109] 钠盐ESIMS显示m/z 600.67,? NMR(400MHz,Me0D)S6.79(d,J = 2.3Hz,lH) ,6.63 (d,J = 8.6Hz,lH) ,6.47(d,J = 8.6Hz,2.3Hz,lH) ,5.34(s,lH) ,4.84(s,lH) ,4.67(t,lH), 4·20(m,2H),3·20-4·OO(glc-H),2·77(s,1H),1·43,1·14(s,6H)。
[0110] 苯丙素类化合物铵盐:ES頂S显示m/z 593.49,核磁特征1H-NMR(600MHz,CD30D): 4 匪R(400MHz,Me0D)S6.70((1, J = 2.3Hz,lH),6.69((1, J = 8.6Hz,lH),6.49((1, J = 8.6Hz, 2·3Ηζ,1Η),5.41(s,lH),4.76(s,lH),4.61(t,lH),4.23(m,2H),3.20-4.00(glc-H),2.77 (s,lH),1.43,1.14(s,6H)〇
[0111] 上述苯丙素类化合物盐的部分结构式如式(Π )~式(VI)所示。
[0113]
[0114] 其中,式(π)为制备得到的苯丙素类化合物盐酸盐,式(m)为制备得到的苯丙素 类化合物的其中一种磺酸盐,式(IV)为制备得到的苯丙素类化合物的其中一种钾盐,式 (V)为制备得到的苯丙素类化合物的其中一种钠盐,式(VI)为制备得到的苯丙素类化合物 的其中一种铵盐。
[0115] 实验例7应用试验
[0116] 本发明所述苯丙素类化合物以及盐对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞氧化应激与 炎症的影响。(为了实验过程中记录方便,以下将本发明所述的苯丙素类化合物标号为:药 物MM-124,即本发明中所述的药物MM-124即是指本发明式(I)所示苯丙素类化合物或其药 学上可接受的盐。)
[0117] 1材料与方法
[0118] 1.1药品及仪器
[0119] 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),MTT购自 Sigma公司;小鼠巨·细胞Raw264 · 7 购自湘雅细胞库;PBS; DMEM高糖培养基、胎牛血清、青霉素与链霉素;全自动酶标仪;恒温 C02培养箱。
[0120] 小鼠白介素 l-f3(IL-1-f3)ELISA检测试剂盒,批号:2014/06(96T);小鼠白介素6 (IL-6)ELISA检测试剂盒,批号:2014/06(96T);小鼠肿瘤坏死因子-a(TNF-a)ELISA检测试 剂盒,批号:2014/06(96T);小鼠一氧化氮(NO)ELISA检测试剂盒,批号:2014/10(96T);小鼠 羟基自由基(OH)ELISA检测试剂盒,批号:2014/10(96T)。
[0121] 1.2药物制备
[0122] 首先用少量DMS0溶解,然后用DMEM稀释至一定的浓度,使终浓度中DMS0含量少于 1%0 〇
[0123] 1.3细胞培养
[0124] 小鼠巨噬细胞Raw 264.7培养于含10%热灭活(56°(:,3〇1^11)的胎牛血清卬83)、 10U/mL青霉素钠、100yg/mL链霉素的DMEM培养基中,37°C、5 % C02恒温培养箱中孵育生长。
[0125] 1.4细胞活力测定
[0126] 细胞活力通过MTT法来测定。将细胞制成细胞悬液接种于96孔板(1 X 104个/孔)孵 育24h,再同步化24h,然后将不同浓度的药物作用于细胞2h,然后再加入LPS(30yg/mL)刺激 24h,吸弃原培养基,每孔加入100yL的MTT(0.5mg/mL)继续孵育4h,吸弃培养基,每孔加入 150yL的DMS0,摇床振摇10min,在490nm处测定吸光度。
[0127] 1.5 N0含量测定
[0128] Raw 264.7细胞接种于96孔板24h,再同步化24h,然后将不同浓度的药物作用于细 胞2h,然后再加入LPS( 30yg/mL)刺激24h,最后收集上清液,并于lOOOOrpm离心5min,分装上 清并置于_80°C保存备用。通过小鼠 N0试剂盒测定N0含量。
[0129] 1.6 炎症因子TNF-a,IL-10,IL_6测量
[0130] 样品取1.5制备好的样品用于后续炎症因子测定。细胞产生TNF-a,IL-lf3,IL_6的 量通过小鼠 TNF-a,IL-Ιβ,IL-6试剂盒来测定。
[0131] 1.7 0H含量测定
[0132] 样品取1.5制备好的样品用于0H因子测定。通过0H试