2和L3/4盘区。（D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度 指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。（E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图 片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。（F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用 于获得椎间盘的盘高度指数。
[0107] 图2-A~图2-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。（A)示出手术前兔脊柱的MRI 放射图片；（B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射产 生TGF-βΙ的软骨细胞，（ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和（iii)使L3/4盘 损伤并且注射1:3比例的产生TGF-βΙ的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物;箭头指向 L1/2和L3/4盘区。（C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并 注射产生TGF-βΙ的软骨细胞，（ii)可以看出脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，和（i ii)使 L3/4盘损伤并且注射1:3比例的产生TGF-βΙ的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物；箭 头指向L1/2和L3/4盘区。(D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘 的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。（E)示出上面(B)中描述的兔的X射 线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图 片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
[0108] 图3-A~图3-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。（A)示出手术前兔脊柱的MRI 放射图片；（B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射产 生TGF-βΙ的软骨细胞，（ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和（iii)使L3/4盘 损伤并且注射1:3比例的产生TGF-βΙ的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物;箭头指向 L1/2和L3/4盘区。（C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高 度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射 图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
[0109] 实施例1V-2用转导的软骨细胞治疗兔穿刺的椎间盘
[0110] 产生TGF-m的软骨细胞的治疗具有抗椎间退化作用。该作用见图4-A~图4-D，其 示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；（B)示出手术 后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使Ll/2盘损伤并注射1:3比例的产生TGF-βΙ的软 骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物，（ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和
[111] 使L3/4盘损伤并注射产生TGF-βΙ的软骨细胞;箭头指向L1/2和L3/4盘区。（C)示出上 面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、 它的退化或再生水平。(D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的 盘高度指数。
[0111] 实施例1V-3用转导的软骨细胞和混合细胞治疗兔穿刺的椎间盘
[0112] 产生TGF-βΙ的软骨细胞的治疗和混合细胞的治疗具有抗椎间退化作用。该作用见 图5-A~图5-D，其示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图 片；（B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射1:3比例的 产生TGF-βΙ的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物，（ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治 疗，为对照组，和（i i i)使L3/4盘损伤并注射产生TGF-βΙ的软骨细胞;箭头指向L1/2和L3/4 盘区。（C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而 测量它的形态、它的退化或再生水平。（D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用 于获得椎间盘的盘高度指数。
[0113] 实施例1V-4未转导的软骨细胞治疗兔穿刺的椎间盘
[0114] 未转导的软骨细胞的治疗具有抗椎间退化作用。该作用见图6-8的各个实验中。图 6-A~图6-D示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。（A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片； (B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基 DMEM，（ i i)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和（ii i)使L3/4盘损伤并注射未转 导的软骨细胞;箭头指向L1/2和L3/4盘区。（C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片， 其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量它的形态、它的退化或再生水平。（D)示出上面 (B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数。
[0115] 图7-A~图7-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。（A)示出手术前兔脊柱的MRI 放射图片；（B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射细 胞培养基DMEM，（ i i)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和（ii i)使L3/4盘损伤并 注射未转导的软骨细胞;箭头指向L1/2和L3/4盘区。（C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放 射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射细胞培养基DMEM，（ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治 疗，为对照组，和（iii)使L3/4盘损伤并注射未转导的软骨细胞;箭头指向Ll/2和L3/4盘区。 (D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测量 它的形态、它的退化或再生水平。（E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获 得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘 的盘高度指数。
[0116] 图8-A~图8-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。（A)示出手术前兔脊柱的MRI 放射图片；（B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)通过针穿刺使T12/L1盘 损伤，无注射，（ii)脊柱部位L1/2处无穿刺和无治疗，为对照组，和(iii)使L2/3盘损伤并注 射未转导的软骨细胞;箭头指向T12/L1和L2/3盘区。（C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放 射图片，其中（i)通过针穿刺使T12/L1盘损伤，无注射，（ii)脊柱部位L1/2处无穿刺和无治 疗，为对照组，和（iii)使L2/3盘损伤并注射未转导的软骨细胞;箭头指向T12/L1和L2/3盘 区。（D)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数从而测 量它的形态、它的退化或再生水平。（E)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片，其用于 获得椎间盘的盘高度指数。(F)示出上面(C)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间 盘的盘高度指数。
[0117] 实施例1V-5用未转导的预处理的软骨细胞治疗兔穿刺的椎间盘
[0118] 预处理的软骨细胞具有抗椎间退化作用。该作用见图9-A~图9-D，其示出损伤盘 的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图片；（B)示出手术后八(8)周兔脊柱 的MRI放射图片，其中（i)使L2/3盘损伤并注射细胞培养基DMEM，（ ii)脊柱部位L3/4处无穿 刺和无治疗，为对照组，和（iii)使L4/5盘损伤并注射预处理的软骨细胞;箭头指向L2/3和 L4/5盘区。（C)示出上面(A)中描述的兔的X射线放射图片，其用于获得椎间盘的盘高度指数 从而测量它的形态、它的退化或再生水平。（D)示出上面(B)中描述的兔的X射线放射图片， 其用于获得椎间盘的盘高度指数。
[0119] 实施例V
[0120] 人软骨细胞来源
[0121] 原始人软骨细胞是从软骨组织中生长的，该软骨组织是从1岁女性人供体的多指 手指的手术切除物中获得。多指组织是在手术室中取出的。在生物安全柜中进行下面程序， 以分离出软骨细胞。用酒精擦拭含有软骨组织的塑料瓶，并利用移液管用无菌PBS(IX)清洗 该软骨组织。通过将7mg胶原酶(Gibco BRL)溶解在IOmL DMEM(含有10%FBS)中并通过0.2μ m注射器式过滤器(Corning)过滤制备胶原酶溶液。在37°C的震荡培养箱中用该胶原酶溶液 处理清洗过的软骨组织17~18小时。第二天，用酒精给该瓶子消毒。用吸管吹打(pipetted up and down)经胶原酶处理的材料数次，从而从该组织块中分离出松散的细胞。用吸管吹 打之后，将上清液通过70μπι尼龙细胞过滤器(Falcon)过滤。失去完整性(例如，松散的细胞） 的经胶原酶处理的组织可以通过该过滤器。将该细胞滤液收集在50mL管子(Falcon)中，并 然后在l，500rpm下离心5分钟。丢弃三分之二的上清液，用IOml无菌PBS(IX)清洗颗粒。再次 将该重悬的细胞在l，500rpm下离心5分钟，并在除去三分之二的上清液之后，用IOml无菌 PBS(IX)清洗。再次将该细胞在l，500rpm下离心5分钟，并然后将其重悬在DMEM(含有10% FBS)中。然后，将该重悬的细胞转移到四个未包被的25cm 2培养瓶中，并在37°C，5%CO2下培 养4天。然后将该细胞转移到两个未包被的185cm 2培养瓶中。培养该细胞2周，然后收集、清 洗并重悬在5:4:1比例的DMEM、FBS和DMSO的冷冻储存培养基中。将该细胞等份放入含有ImL 4 X IO5细胞/mL的细胞悬浮物的冷冻管中。将该细胞保存在气相液氮存储器中。
【主权项】
1. 软骨细胞在制备用于阻止或延缓椎间盘缺损部位的椎间盘退化的药物中的应用，所 述应用包括:将所述软骨细胞的药物制剂注射到所述椎间盘缺损部位中，其中所述软骨细 胞为已经与人分离并且体外培养和繁殖的非盘软骨细胞或幼年软骨细胞。2. 根据权利要求1所述的应用，其中所述软骨细胞是相对哺乳动物的同种异体型。3. 根据权利要求1所述的应用，其中所述软骨细胞为预处理的软骨细胞。4. 根据权利要求2所述的应用，其中所述哺乳动物是人。
【专利摘要】本发明提供了椎间盘退化的治疗。本发明公开了一种阻止或延缓椎间盘缺损部位的椎间盘退化的方法，其包括将哺乳动物结缔组织细胞注射到所述椎间盘缺损部位。
【IPC分类】A61P19/08, A61K35/32
【公开号】CN105640992
【申请号】
【发明人】卢文钟, 康诚佑, 裵贤友, 李宽熙
【申请人】组织基因公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2009年3月23日