不同状况。滑行椎间 盘、破裂椎间盘，或膨出椎间盘都可以表示相同的医学病况。椎间盘突出到邻近椎体中称为 许莫氏结节(Schmorl，nodes)。
[0044] 预处理的细胞治疗
[0045] 本发明包括向哺乳动物的椎间盘区施用预处理的细胞从而通过阻止或延缓椎间 盘退化治疗损伤的椎间盘。预处理的细胞典型地为结缔组织细胞，并包括软骨细胞或成纤 维细胞。
[0046] 例如，当原始软骨细胞群被传代约3或4次时，它们的形态典型地变为形成纤维的 软骨细胞(fibroblastic chondrocyte)。由于原始软骨细胞被传代，因此它们开始丧失一 些软骨细胞特征，并开始呈现形成纤维的软骨细胞特征。当用细胞因子，例如TGF-β超家族 蛋白质孵化或"预处理"这些形成纤维的软骨细胞时，这些细胞可重新获得软骨细胞特征， 该特征包括产生胶原蛋白。
[0047]此种预处理的细胞包括形成纤维的软骨细胞，该形成纤维的软骨细胞已用TGFm 孵化并从而恢复为产生胶原蛋白的软骨细胞。使用预处理的细胞延缓椎间盘退化的优点在 于容易形成可用于引入到椎间盘中产生胶原蛋白的软骨细胞，另外的优点在于可维持软骨 基质。
[0048]该细胞可包括但不限于原始细胞或已经历约1次~20次传代的细胞。该细胞可以 是结缔组织细胞。该细胞可包括已经历形态发生变化的细胞，其中预处理使原始细胞特性 恢复。该细胞包括但不限于软骨细胞、成纤维细胞，或形成纤维的软骨细胞。预处理可这样 进行，即，用细胞因子孵化该细胞至少40小时，或1~40小时、2~30小时、3~25小时、4~20 小时、5~20小时、6~18小时、7~17小时、8~15小时或9~14小时，然后可选地将该细胞与 该细胞因子分离，并将该预处理的细胞注射到感兴趣的软骨缺损部位以便产生软骨，优选 透明软骨。一方面，该细胞因子可以为TGF-β超家族成员。特别地，该细胞因子可以是TGF-β， 特别是TGF-βΙ。
[0049] 该预处理孵化混合物中存在细胞因子，其量可以充分"预处理"软骨细胞从而使它 对椎间治疗方法有用。在这方面，该预处理孵化混合物可含有至少约lng/ml细胞因子。特别 地，该混合物含有的细胞因子量可以为约1~l〇〇〇ng/ml、约1~750ng/ml、约1~500ng/ml、 约1~400ng/ml、约1~300ng/ml、约1~250ng/ml、约1~200ng/ml、约1~150ng/ml、约1~ 100ng/ml、约1~75ng/ml、约1~50ng/ml、约10~500ng/ml、约10~400ng/ml、约10~300ng/ ml、约10~250ng/ml、约10~200ng/ml、约10~150ng/ml、约10~100ng/ml、约10~75ng/ml、 约10~50ng/ml、约15~500ng/ml、约15~400ng/ml、约15~300ng/ml、约15~250ng/ml、约 15~200ng/ml、约15~150ng/ml、约15~100ng/ml、约15~75ng/ml、约15~50ng/ml、约20~ 500ng/ml、约20~400ng/ml、约20~300ng/ml、约20~250ng/ml、约20~200ng/ml、约20~ 150ng/ml、约20~100ng/ml、约20~75ng/ml、约20~50ng/ml、约25~500ng/ml、约25~ 400ng/ml、约25~300ng/ml、约25~250ng/ml、约25~200ng/ml、约25~150ng/ml、约25~ 100ng/ml、约25~75ng/ml、约25~50ng/ml、约30~500ng/ml、约30~400ng/ml、约30~ 300ng/ml、约30~250ng/ml、约30~200ng/ml、约30~150ng/ml、约30~100ng/ml、约30~ 75ng/ml、约30~50ng/ml、约35~500ng/ml、约35~400ng/ml、约35~300ng/ml、约35~ 250ng/ml、约35~200ng/ml、约35~150ng/ml、约35~100ng/ml、约35~75ng/ml、约35~ 50ng/ml、约40~500ng/ml、约40~400ng/ml、约40~300ng/ml、约40~250ng/ml、约40~ 200ng/ml、约 40 ~150ng/ml、约 40 ~100ng/ml、约 40 ~75ng/ml 或约 40 ~50ng/ml。
[0050] 实施本发明的一个方法可包括用细胞因子孵化细胞一定的时间从而形成预处理 的细胞，和可选地将细胞因子与该细胞分离，以及将该预处理的细胞注射到椎间盘或靠近 它的感兴趣部位中。或者，可用感兴趣的细胞因子孵化该细胞一段时间，并可在不分离出细 胞因子的情况下将该组合物施用到缺损部位。
[0051] 应当理解，尽管在本发明的预处理细胞治疗方案中可一起植入诸如支架或框架以 及各种外源性组织等物质，但本发明的注射系统中也可以不包括此种支架或组织。在创造 性体细胞治疗的优选实施例中，本发明涉及将预处理的结缔组织细胞群注射到椎间盘间隙 中的简单方法。
[0052] 技术人员应当理解，用于治疗人患者的细胞来源可以是患者自身的结缔组织细 胞，例如自体成纤维细胞或软骨细胞，但也可使用所有的同种异体细胞以及异种细胞，无需 考虑细胞的组织相容性。或者，在本发明的一个实施例中，可以使用与哺乳动物宿主的组织 相容性匹配的同种异体细胞。为进一步详细地描述，确定供体和患者的组织相容性以便向 哺乳动物宿主施用组织相容性细胞。同样地，也可异体地使用幼年软骨细胞，无需确定供体 和患者之间的组织相容性。
[0053] 基因递送
[0054] 一方面，本发明公开了递送感兴趣的DNA序列到哺乳动物宿主结缔组织细胞的离 体法(ex vivo)和体内（in vivo)技术。该离体法技术涉及培养祀结缔组织细胞、体外转染 DNA序列、将DNA载体或其它感兴趣的递送载体导入到结缔组织细胞中，然后将该修饰的结 缔组织细胞移植到哺乳动物宿主的靶区域中，以便影响感兴趣基因产物的体内表达。
[0055]应当理解，尽管在本发明方案中可一起植入诸如支架或框架以及各种外源性组织 等物质，但优选本发明的注射系统中不包括此种支架或组织。在一个实施例中，本发明涉及 将TGF超家族蛋白质或者培养的、未转染/未转导的或转染/转导的结缔组织细胞群或其混 合物注射到椎间盘间隙中的简单方法，以便外源性TGF超家族蛋白质在椎间盘间隙中被表 达或是活性的。
[0056]技术人员应当理解，用于治疗人患者的一种细胞来源是患者自身的结缔组织细 胞，例如自体软骨细胞。另一种细胞来源包括同种异体细胞，无需考虑该细胞对需要治疗的 患者的组织相容性。
[0057]更具体地，这个方法包括采用基因产物，或其生物活性衍生物或片段。该基因产物 为转化生长因子β超家族成员，或其生活活性衍生物或片段。
[0058] 在本发明的另一个实施例中，提供了用于肠胃外给予病人治疗有效量的化合物， 该化合物含有TGF-β超家族蛋白质和合适的药物运载体。
[0059] 本发明的另一个实施例提供了用于肠胃外给予病人预防有效量的化合物，该化合 物包括TGF-β超家族蛋白质和合适的药物运载体。
[0060] 在治疗应用中，TGF-β蛋白质可配制用于局部给药。技术和配方一般可在 Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack出版公司，Easton,Pa.，最新版中找到。活性 成分TGF蛋白质一般与运载体结合，例如赋形剂稀释液，其可包括填充剂、补充剂、粘合剂、 湿润剂、崩解剂、表面活性剂、可侵蚀性聚合物或润滑剂，这取决于给药模式和剂型特点。典 型剂型包括粉剂，包括悬浮剂、乳剂和溶液的液体制剂，颗粒和胶囊。
[0061] 本发明TGF蛋白质也可与药物可接受的运载体结合以便给予受试者。合适的药物 可接受的运载体实例是多种多样的阳离子脂质，包括但不局限于N-(l-2,3-二油基氧基)丙 基）-η，η，η-三甲基氯化铵（DOTMA)和二油基磷脂酰乙醇胺（dioIeoylphophotidyl ethanolamine)(D0PE)。脂质体也是本发明TGF蛋白质分子的合适的运载体。另外合适的运 载体是缓释凝胶或包含TGF蛋白质分子的聚合物。
[0062] TGFP蛋白质可与大量生理可接受的运载体或稀释液混合，例如生理盐水或其它合 适的液体。TGF蛋白质分子也可与其它运载体装置结合从而保护该TGF蛋白质和其生物活性 形式在到达它们的靶之前不被降解和/或促进该TGF蛋白质或其生物活性形式穿过组织屏 障。
[0063]本发明的进一步实施例包括在转染细胞之前储存结缔组织细胞。所属领域技术人 员应当理解，该结缔组织细胞可冷冻储存在于液氮中的10 % DMSO中。
[0064]在本申请中，提供了通过注射用编码转化生长因子KTGF-β)超家族成员的基因转 染或转导的适当的哺乳动物细胞，使椎间盘再生或阻止椎间盘退化的方法，该TGF-β超家族 成员包括，但不限于BMP-2和TGF-m、2和3。
[0065]在本申请的另一个实施例中，提供了通过注射未用编码转化生长因子iKTGF-β)超 家族成员的基因转染或转导，或者未用任何其它基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞， 阻止或延缓椎间盘退化的方法。另一方面，本发明涉及通过使用上述方法阻止或延缓椎间 盘退化来治疗损伤或退化的椎间盘。
[0066]在本申请的另一个实施例中，提供了通过注射用编码转化生长因子iKTGF-β)超家 族成员的基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞，延缓或阻止椎间盘退化的方法。另一方 面，本发明涉及通过使用上述方法阻止或延缓椎间盘退化来治疗损伤或退化的椎间盘。 [0067]在本发明的另一个实施例中，提供了通过注射用编码转化生长因子iKTGF-β)超家 族成员的基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞，和未用编码转化生长因子KTGF-β)超家 族成员的基因转染或转导或者未用任何其它基因转染或转导的适当的哺乳动物细胞的组 合物或混合物，阻止或延缓椎间盘退化的方法。
[0068] 在本发明的实施例中，应当理解，可将该细胞注射到其中椎间盘退化需要通过使 用上述细胞组合物阻止或延缓的区域中，该组合物含有或不含有支架材料或任何其它辅助 材料，例如外源性细胞或任何其它生物相容性载体。也就是说，可将仅经修饰的细胞、仅未 经修饰的细胞，或其混合物或组合物注射到其中椎间盘退化需要被阻止或延缓的区域中。
[0069] 下列实例是为了说明本发明，而不是限制。
[0070] 实施例
[0071 ]实施例1-材料和方法 [0072] 脂粒构建