[0073]通过将含有TGF-βΙ编码序列和3'末端处的生长激素聚A位点的1.2-kb Bgl II片 段亚克隆到pMTMLV的Bam HI位点中，产生质粒pMTMLVPUpMTMLV载体通过除去全部gag和 env序列以及一些Φ包装序列从逆转录病毒载体MGF衍生而得。
[0074]细胞培养和转导-将在逆转录病毒载体中克隆的TGF-ikDNA单独转导到软骨细胞 (hChon-TGF-βΙ)中。在含 10%胎牛血清的Dulbecco ' s改良Eagles培养基（GIB⑶-BRL, Rockville ,MD)中培养这些软骨细胞。
[0075]为了选择具有转导的基因序列的细胞，将新霉素(300μg/ml)加入到该培养基中。 有时将具有TGF-m表达的细胞储存在液氮中，在注射之前进行培养。
[0076] 用Fugene转染方法将pMTMLVm和pVSVG质粒DNA共转染到GP2-293细胞中。培养48 小时之后，用0.45μπι聚砜过滤器过滤上清液。该滤过的培养上清液然后用培养基和10%FBS 进行二倍稀释，并用来感染人软骨细胞。用该滤液和聚凝胶(8μg/ml，Sigma，St. Louis ,MO) 对感染前18小时在60mm培养皿中接种的人软骨细胞进行感染。培养4小时之后，用新鲜培养 基替换该培养基。24小时之后，用储存的病毒上清液进行重复感染。在二次感染之后，在含 10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养该转导的细胞。将挑选的菌落转移到24 或6孔板中，并使用Quantikine ELISA分析试剂盒(R&D system,Minneapolis,MN)测量TGF-β?产量。
[0077] 椎间盘高度的X射线放射图片分析
[0078]在穿刺后每周（various week intervals)施用盐酸氯胺酮（25mg/kg)和Rompun (lmg/kg)之后，拍摄X射线放射图片。应特别小心地将每个动物在X射线放射图片拍摄期间 和每个时间的麻醉维持在一致水平上，从而获得相似程度的肌肉松弛，肌肉松弛可影响椎 间盘高度。因此，总是用术前X射线放射图片作为基线测量。也应尽量将脊柱保持在轻度屈 曲位。为了减小来自脊柱的轴向旋转和光束发散角的误差，对处于侧卧位的每个动物重复 拍摄X射线放射图片至少两次，将光束集中在距离兔髂嵴4cm处。数字化扫描X射线放射图 片，并使用图像捕捉软件进行数字化存储。
[0079]影像分析
[0080] 利用数字化放射图片，运用公用图像分析软件分析包括椎体高度和IVD高度的测 量值。将数据导入Excel软件中，使用Lu等人的方法将IVD高度表示为DHI/'Effects of chondroitinase ABC and chymopapain on spinal motion segment biomechanics〇An in vivo biomechanical,radiologic,and histologic canine study"，Spinel997;22: 1828-34。通过求得从IVD的前部、中部和后部获得的测量值的平均值并将它除以相邻椎体 高度的平均值，计算出平均IVD高度(DHI)。被注射的椎间盘的DHI变化表示为DHI%，并归一 化到术前IVD高度(DHI%=术后DHI/术前DHI X 100)。使用下面等式计算出受试者内部标准 差：
[0081] Σ(Χ1-χ2)2/2η)
[0082] 其中Xl是第一测量值，Χ2是第二测量值，并且η = 450。按(Sw/所有测量结果的平均 值X 100)计算变异系数百分率(CV% )。腿1测量的观察者内误差（intraobserver error)估 算为极小（Sw :0.001800316 ;CV% :3.13)。报道DHI测量的观察者间误差（interobserver error)也很小（Sw:0.003227;CV% :9.6)〇
[0083] MRI 评价
[0084] 使用带有正交象限线圈接收器（quadrature extremity coil receiver)的0.3-T 成像仪(Airis ΙΙ，4·0Α版;Hitachi Medical System America,Inc.)对本研究中的所有兔 进行MRI检查。处死之后，分离出带有周围软组织的脊柱，对其进行MRI分析。在下面环境中 获得矢状面中的T2-权重横断面:快速自旋回波序列，TR(重复时间）4000毫秒和TE(回波时 间）120毫秒、256(h) X 128(v)矩阵、视野(field of view)260、刺激次数4次。层厚(section thickness)为2mm，间距为0-mm。基于1~4级（1 =正常、2 =信号强度降低极小但高信号范围 明显缩小、3 =信号强度降低中度，以及4 =信号强度降低严重）信号强度的等级和范围变 化，不知情的观察者利用改良的Thompson分类法评价MRI。基于2次评价，MRI分级的观察者 内和观察者间的可信度相关系数优异(分别为K = 0.98、0.90)，如Cohen kappa相关系数确 定的。
[0085]实施例1I-实验方法和结果 [0086]阻止损伤的椎间盘退化
[0087] 使用新西兰白色雄性兔。运用开放式手术技术。用实验方法治疗每个动物腰脊柱 的3个椎间层面:L2-3、L3-4、L4-5或将它们作为对照组观察。均衡治疗这些层面，观察每个 兔的多个部位/盘。在主题设计范围内，手术前后的比较、盘层面的变化用作对照。
[0088] 实施例1II
[0089]通过仅将未转导的软骨细胞、仅产生TGF-βΙ的软骨细胞，或混合的细胞(人软骨细 胞和产生TGF-m的软骨细胞)注射到兔中，阻止损伤的椎间盘退化
[0090] 实施例1-V中使用的软骨细胞都是非盘软骨细胞，并且是从小于2岁孩子手指的透 明软骨部分中获得的幼年软骨细胞。
[0091] 在腰脊柱椎间盘中进行针穿刺。针穿刺之后，注射产生TGF-m的软骨细胞、原始未 转导的人软骨细胞、产生TGF-m的软骨细胞和原始未转导的人软骨细胞的混合物、预处理 的未转导的人软骨细胞或运载体/培养基。使用多个对照组。实验条件在下表1中列出。
[0092] 表1 手术准备 注射治疗 针穿钊 产生TGF-β 1的软骨细胞(~5 X IOft个细胞） 、 混合：产生TGF-βΙ的软骨细胞 针芽刺 ， 原始未转导的人软骨细胞(~3至1的比例，5 X I ()6)
[0093] 针穿刺 原始未转导的人软骨细胞(~5 X丨()6) 计穿钊 预处理的未转导的人软骨细胞(~5 X K)6) 针穿钊 DMEM 针穿剌 仅针穿刺，未注射 未穿刺 未针穿刺未治疗的对照组
[0094] 简言之，在兔或猪的腰脊柱椎间盘中进行针穿刺损伤。在这个针穿刺之后，让兔愈 合4周。然后在第二手术程序中，注射包括产生TGF-m的软骨细胞和/或原始未转导的人软 骨细胞(~5 X IO5)的实验治疗组合物，或者观察对照条件(表1)。
[0095] 在气管内插管，和例如通过施用盐酸氯胺酮和Rompun?实现全身麻醉之后，将 动物摆成侧卧位。使用乳酸林格液(Lactated ringers)，约（5ml/kg/hr)。切口区脱毛、备 皮、交替地用聚烯吡酮磺擦洗和酒精擦拭(>3次)进行常规消毒铺巾。将温和的眼药膏放在 眼睛上。采用左侧腹膜后途径暴露L2~L5(兔具有6~7个腰椎体)椎间盘的右前面观。使用 各种准备方案，并将治疗方案应用到每个盘层面。对于椎间盘的"针穿刺"准备，使用18号针 穿刺椎间盘，穿刺深度为5mm(Aoki 等人〃 Nerve fiber ingrowth into scar tissue formed following nucleus pulposus extrusion in the rabbit anular-puncture disc degeneration model: effects of depth of puncture·''Spine·2006;31(21):E774_ 80)。穿刺之后，注射表1中列出的测试材料。将测试组合物给予到每只兔的1^1-2、1^-3丄3-4、L4-5区中的任何一个中。
[0096] 每月使用X射线放射图片监测任何盘的变化。在手术后2、8和24周处死动物。
[0097]放射图片/MRI。相比其它盘层面处的盘，基线处(手术前(pre op))相同盘的盘高 度增大的可检测的放射图片的变化指示愈合。仅在针穿刺之前和之后与其它盘相比较，前 后均未针穿刺的其它盘随时间逐渐产生正常退化指数。
[0098] 逆转录PCR。进行逆转录PCR从而测定存活的转染的软骨细胞相对量。
[0099] 组织学分析。也利用组织学分析确认胶原蛋白I型和II型的特性，新生软骨细胞的 大体形态和评价(evaluation)。
[0100] Western印迹分析和/或ELISA。胶原蛋白I型和II型的定量表达、蛋白聚糖浓度、 Smads 2/3、Sox-9。另外，利用ELISA评价了6邱-1、81032、81037、〇^5以及其它具有可用抗体的 相关生长因子。
[0101 ]通过观察Capase-3的表达，在椎间盘其它组织结构中检查细胞凋亡情况。
[0102] 实施例1V [0103] 结果
[0104] 结果如图和本申请附图描述中所示。与载体对照组相比，仅用未转导的软骨细胞、 仅用转导的软骨细胞、仅用预处理的软骨细胞，或转导和未转导的软骨细胞混合物治疗的 穿刺的椎间盘表现出阻止或延缓盘退化的有益作用。
[0105] 实施例1V-I用混合细胞(转导和未转导的软骨细胞)治疗兔穿刺的椎间盘
[0106] 当对兔测试时，混合细胞的治疗具有抗椎间退化的作用。该作用见图1-4的各个实 验。图I-A~图I-F示出损伤盘退化的减慢、延缓或阻止。(A)示出手术前兔脊柱的MRI放射图 片；（B)示出手术后四（4)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射产生TGF-β 1的软骨细胞，（ii)可以看出脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，和（iii)使L3/4盘损伤并且 注射1:3比例的产生TGF-βΙ的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物;箭头指向L1/2和L3/ 4盘区。（C)示出手术后八(8)周兔脊柱的MRI放射图片，其中（i)使L1/2盘损伤并注射产生 TGF-βΙ的软骨细胞，（ii)脊柱部位L2/3处无穿刺和无治疗，为对照组，和（iii)使L3/4盘损 伤并且注射1:3比例的产生TGF-βΙ的软骨细胞和未转导的人软骨细胞混合物;箭头指向LI/