扩增产 物，说明该反应在8种动物中具有特异性。
[0061] 实施例3以牛TNFRSF10A基因的引物对III作为引物进行PCR扩增
[0062] 1)各物种总DNA样品的处理：将8种动物的总DNA样品稀释到50ng/ μ 1，作为总 DNA模板，并将引物稀释至10ymol/L〇
[0063] 2)反应体系的配制：在PCR管中加入如下各反应组分，反应体系50 μ 1/管。双蒸 水 36 μ I，10*PCR 反应缓冲液 5 μ 1，2. 5mM 的 dNTPs 4 μ 1，2. 5U/ μ 1 的 Taq 酶 2 μ 1，总 DNA 模板ΙμL，10 μ M引物对III的正向引物?μL和10 μ M引物对III的反向引物?μL，其中 Taq酶为常规Taq酶（参见Tiangen公司的Taq酶说明书）。
[0064] 3)PCR反应程序的制定：依次进行95°C下预变性10min，94°C变性30s，52°C退火 45s，72°C延伸90s，进行35次循环，72°C下延伸lOmin，最后在4°C下保持Imin后结束，得 PCR反应产物。
[0065] 4)2wt%琼脂糖凝胶电泳：同实施例1，所得凝胶成像结果如图4所示。
[0066] 用牛的特异性引物分别扩增8种动物的基因组，空白对照用1 μ I H2O代替DNA模 板。由图4可知，牛肉样品DNA得到190bp的目的条带，其他7种肉样和空白对照无扩增产 物，说明该反应在8种动物中具有特异性。
[0067] 由实施例1-3可知，引物对I仅对猪物种具有特异性，引物对II仅对羊物种具有 特异性，引物对ΠΙ仅对牛物种具有特异性。
[0068] 实施例4
[0069] 以猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合后，使不同组合的猪羊牛每 种动物的最终DNA浓度为50ng/ μ 1，作为样品模板。
[0070] 1)混合总DNA样品的处理：将猪、羊、牛3种动物的总DNA样品按照不同组合混合 后，使不同组合的猪、羊、牛每种动物的最终DNA浓度为50ng/μ 1，作为样品模板，并将引物 稀释至10 μ mol/L〇
[0071] 总DNA样品的不同组合为：猪，羊，牛，猪+羊，猪+牛，羊+牛，猪+牛+羊。
[0072] 2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50 μ 1/管。 双蒸水 32 μ I，10*PCR 反应缓冲液 5 μ I，2. 5mM 的 dNTPs 4 μ I，2. 5U/ μ 1 的 Taq 酶 2 μ 1，总 DNA模板1 μ 1，10 μ M引物对I、引物对II、引物对III的正向引物各1 μ 1和10 μ M引物对 I、引物对II、引物对III的反向引物各1 μ 1，其中Taq酶为常规Taq酶（参见Tiangen公 司的Taq酶说明书）。
[0073] 3) PCR反应程序的制定：同实施例1。
[0074] 4) 2wt. %琼脂糖凝胶电泳：同实施例1，所得凝胶成像结果如图5所示。
[0075] 用猪、羊、牛的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增7种不同组合的 基因组，空白对照用1 μ I H2O代替DNA模板，每个反应重复2次。由图5可知，各物种特异 性引物均能很好的从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，很好的验 证了复杂总DNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。
[0076] 实施例5猪羊牛动物源性成分检测的多重PCR检测试剂盒
[0077] 根据上述实施例1-3和实施例4中所述的PCR反应体系，本发明所述引物体系可 以配合相关试剂组装成不同组合的试剂盒，用于对猪羊牛物种检测及相关肉产品的真伪及 掺假鉴定。
[0078] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。
【主权项】
1. 一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系，其包括如下引物对I、引物 对II和引物对III : 1) 针对猪12SrRNA基因设计引物对I : 正向引物：5 ' -CTACATAAGATATCCACCACA-3 ' ； 反向引物：5' -ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3' ； 2) 对羊细胞色素 c氧化酶亚基III基因设计引物对II : 正向引物：5 ' -TACACTGTACAGGCATCAG-3 ' ； 反向引物：5' -CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3' ； 3) 对牛TNFRSF10A基因设计引物对III : 正向引物：5 ' -CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3 ' ； 反向引物：5 ' -CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3 '。2. -种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其包括如下步骤： 1) 以待检样品总DNA为模板，利用如权利要求1所述的多重PCR引物体系进行多重 PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所待检述样品总DNA模板 为猪、羊、牛物种肉产品中的一种或一种以上； 2) 结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分；待检样品扩 增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分；待检样品扩增出190bp条带的，判定待检 样品为牛源性成分。3. 根据权利要求2所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其特征 在于，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：4. 根据权利要求2或3所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其 特征在于，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：5. 根据权利要求2所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其 特征在于，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行90-100 °C下预变性 5-20min，90-100°C变性 20-60s，50-60°C退火 30-60s，70-74°C延伸 60-150s，进行 30-60 次 循环，70-74°C下延伸5-20min，最后在4-20°C下保持> Imin后结束。6. 根据权利要求2或5所述的快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其 特征在于，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行95°C下预变性lOmin， 94°C变性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，进行35次循环，72°C下延伸lOmin，最后在4°C 下保持Imin后结束。7. 如权利要求2-6任一项所述的多重PCR检测方法在用于单物种总DNA模板进行猪、 羊或牛的物种检测中的应用。8. 如权利要求2-6任一项所述的多重PCR检测方法在用于多物种混合总DNA模板进行 猪、羊、牛中两种以上的多重物种检测中的应用。9. 如权利要求2-6任一项所述的多重PCR检测方法在猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定 中的应用。10. -种含有如权利要求1所述多重PCR引物体系的快速检测猪羊牛动物源性成分的 多重PCR检测试剂盒。
【专利摘要】一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法，包括如下步骤：以待检样品总DNA为模板，利用所述引物对I、引物对II和引物对III组成的多重PCR引物体系进行多重PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种肉产品中的一种或多种。本发明所述多重PCR检测方法能快速、高特异性检测猪羊牛肉制品的真伪及是否有掺假，大大提高检测效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于猪羊牛制品的快速防伪鉴定。此外，本发明所设计的多重PCR引物体系配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105177150
【申请号】
【发明人】王金斌, 唐雪明, 李文, 潘爱虎, 贾军伟, 白蓝, 蒋玮, 李鹏, 吴潇, 吕贝贝, 刘华
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月29日