和 值越高），也和引物与模板的结合能力、引物之间形成二聚体的能力有关，引物与模板的结 合能力越强、形成二聚体越少，饱和值就越低，反之越高。
[0033] 本发明所述多重PCR检测方法用于单物种总DNA模板进行猪、羊、牛的物种检测， 且所述多重PCR检测方法用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的的物种检 测。所述多重PCR检测方法尤其适用于检测猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定。
[0034] 本发明还提供一种含有本发明所述多重PCR引物体系的快速检测猪羊牛动物源 性成分的多重PCR检测试剂盒。
[0035] 本发明所述多重PCR检测试剂盒可以将本发明所述PCR引物体系以及相关试剂组 装成试剂盒，以方便使用。其中，所述相关试剂可以为本发明中所述PCR反应体系中除了总 DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反 应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外 本发明所述多重PCR检测试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。
[0036] 本发明所述多重PCR试剂盒用于单物种总DNA模板进行猪、羊、牛的物种检测，且 所述多重PCR试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行猪、羊、牛中两种以上的物种检测。所 述试剂盒尤其适用于检测猪、牛、羊产品的真伪及掺假鉴定。
[0037] 本发明的有益效果是：
[0038] 1.本发明的多重PCR引物体系中的引物对均仅对各自物种的目标片段进行特异 性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此，使用本发明的多重PCR引物 体系可以一次性检测猪、羊、牛3个动物物种，从而有效的缩短检测时间。
[0039] 2.本发明所述多重PCR检测方法经一次PCR即可鉴别3种动物源性成分，不需要 对每种动物源性成分分别进行确证检测，大大缩短了实验时间，加快了检出速度。本发明优 化了特定PCR反应体系及反应程序，采用统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快 速高效且特异性高的检测方式，尤其适用于猪、羊、牛制品的快速防伪鉴定。
[0040] 3.本发明的多重PCR引物体系及PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便 等优点，较普通PCR更为快速、简便，可实现同时对3种动物源性成分的快速、准确、特异的 检测和分析，从而有效的鉴定猪羊牛肉制品的真伪及掺假情况，为猪、羊、牛肉制品的质量 控制提供了现代分子生物学的检测手段。
[0041] 4.本发明所述多重PCR引物体系配合相关试剂制成多重PCR试剂盒，方便使用，同 时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。
【附图说明】
[0042] 图1是本发明实施例中各种动物肉产品提取出的总DNA模板的琼脂糖凝胶电泳 图；其中，1 :猪，2 :羊，3 :牛，4 :鸡，5 :鸭，6 :狗，7 :马，8 :兔，M代表标准核酸分子量标签 (15000 为 DNA 标准分子量，自上向下依次为 15kb，10kb，7500bp，5000bp，2500bp、1000 bp 和 250bp)〇
[0043] 图2是本发明实施例1进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，I :猪，2 :羊， 3 :牛，4 :鸡，5 :鸭，6 :狗，7 :马，8 :兔，N :空白对照，M代表标准核酸分子量标签（2000为DNA 标准分子量，自上向下依次为 15kb，10kb，7500bp，5000bp，2500bp、1000bp 和 250bp)。
[0044] 图3是本发明实施例2进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1 :羊，2 :猪， 3 :牛，4 :鸡，5 :鸭，6 :狗，7 :马，8 :兔，N :空白对照，M代表标准核酸分子量标签（2000为DNA 标准分子量，自上向下依次为21*，11*，75(^口，50(^口，25(^口和10(^口）。
[0045] 图4是本发明实施例3进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1 :牛，2 :猪， 3 :羊，4 :鸡，5 :鸭，6 :狗，7 :马，8 :兔，N :空白对照，M代表标准核酸分子量标签（2000为DNA 标准分子量，自上向下依次为21*，11*，75(^口，50(^口，25(^口和10(^口）。
[0046] 图5是本发明实施例4以各物种总DNA样品按同体积混合后的混合总DNA样品为 模板，使用各物种特异性引物分别与此混合总DNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳 图；其中，1和2 :猪，3和4 :牛，5和6 :羊，7和8 :猪+牛+羊，9和10 :猪+牛，11和12 :猪 +羊，13和14 :羊+牛，N :空白对照，M代表标准核酸分子量标签（2000为DNA标准分子量， 自上向下依次为 2kb，lkb，750bp，500bp，250bp 和 IOObp)。
【具体实施方式】
[0047] 以下结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案。
[0048] 实施例1以猪12S rRNA基因的引物对I作为引物进行PCR扩增
[0049] 以各物种总DNA样品为总DNA模板，总DNA模板的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。 由图1可知，各种动物样品提取的基因组DNA片段均一，条带清晰，为基于核酸水平的PCR 反应的提供个良好的模板。
[0050] 1)各物种总DNA样品的处理：将8种动物的总DNA样品稀释到50ng/ μ 1，作为总 DNA模板，并将引物稀释至ΙΟμ mol/Lo
[0051] 2)反应体系的配制：在PCR管中加入如下各反应组分，反应体系50 μ 1/管。双蒸 水 36 μ I，10*PCR 反应缓冲液 5 μ 1，2. 5mM 的 dNTPs 4 μ 1，2. 5U/ μ 1 的 Taq 酶 2 μ 1，总 DNA 模板ΙμL，10 μ M引物对I的正向引物ΙμL和10 μ M引物对I的反向引物ΙμL，其中Taq 酶为常规Taq酶（参见Tiangen公司的Taq酶说明书）。
[0052] 3)PCR反应程序的制定：依次进行95°C下预变性10min，94°C变性30s，52°C退火 45s，72°C延伸90s，进行35次循环，72°C下延伸lOmin，最后在4°C下保持Imin后结束，得 PCR反应产物。
[0053] 4)2wt%琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt. %琼脂糖凝胶电 泳，凝胶中加入溴化乙锭（EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迀移至 凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图2所示。
[0054] 用猪的特异性引物分别扩增8种动物的基因组，空白对照用1 μ I H2O代替DNA模 板。由图2可知，猪肉样品DNA得到290bp的目的条带，其他7种肉样和空白对照无扩增产 物，说明该反应在8种动物中具有特异性。
[0055] 实施例2以羊cytochrome c oxidase subunit III基因的引物对II作为引物进 行PCR扩增
[0056] 1)各物种总DNA样品的处理：将8种动物的总DNA样品稀释到50ng/ μ 1，作为总 DNA模板，并将引物稀释至ΙΟμ mol/Lo
[0057] 2)反应体系的配制：在PCR管中加入如下各反应组分，反应体系50 μ 1/管。双蒸 水 36 μ I，10*PCR 反应缓冲液 5 μ 1，2. 5mM 的 dNTPs 4 μ 1，2. 5U/ μ 1 的 Taq 酶 2 μ 1，总 DNA 模板ΙμL，10 μ M引物对III的正向引物?μL和10 μ M引物对III的反向引物?μL，其中 Taq酶为常规Taq酶（参见Tiangen公司的Taq酶说明书）。
[0058] 3)PCR反应程序的制定：依次进行95°C下预变性10min，94°C变性30s，52°C退火 45s，72°C延伸90s，进行35次循环，72°C下延伸lOmin，最后在4°C下保持Imin后结束，得 PCR反应产物。
[0059] 4) 2wt%琼脂糖凝胶电泳：同实施例1，所得凝胶成像结果如图3所示。
[0060] 用羊的特异性引物分别扩增8种动物的基因组，空白对照用1 μ I H2O代替DNA模 板。由图3可知，羊肉样品DNA得到370bp的目的条带，其他7种肉样和空白对照无