一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重pcr引物体系及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重 PCR引物体系及检测方法。
【背景技术】
[0002] 民以食为天，食以安为先，吃放心健康绿色的肉类制品是食品质量安全的一个重 要方面。但是，在动物源性原料和加工产品中，经常出现动物成分的掺假造假掺杂和无意污 染现象。国内市场近期曝光的多起肉类掺假事件引发了公众对食品安全的担忧。即使是 "拥有世界上最严格食品安全制度"的欧洲，亦难免出现"挂牛头卖马肉"的造假现象，值得 人们深思。在肉类掺假形式层出不穷的情势下，对动物源性成分鉴别技术的研究逐步成为 食品安全领域的研究热点。
[0003] 许多领域急需标准化的准确快速检测方法，比如超市里面的羊、牛肉卷是否掺杂 了猪肉，在真皮制品选购方面皮革制品是否为真皮。特别是一些涉及宗教饮食禁忌方面的 食物，极其容易引发民族矛盾，影响安定团结。着眼点放在食品中动物源性肉及肉制品成分 种类识别技术上，研究动物源性肉及肉制品安全检测技术，建立快速、准确的高通量的检测 方法，对食品进行动物源性肉及肉制品成分鉴定，对加工肉制品的质量进行把关，有利于维 护消费者利益，保障人民生命安全，避免假冒伪劣食品的出现，为打击此类违法行为提供技 术支撑，也有利于肉类产业的健康发展。
[0004] 目前，为了确定肉及肉制品的真实性，已经研发出了包括基于核酸的分子生物学 技术，如PCR、实时定量PCR和分子指纹技术，基于蛋白质分子结构的免疫分析技术，红外光 谱技术以及质谱技术等动物源性成分鉴别方法。基于动物种属间遗传信息的差异，从核酸 分子水平上对动物进行肉种鉴定以及对动物源性食品进行检验研究，是目前动物源性成分 研究的最有效手段，作为鉴别的检测靶点而被广泛使用。
[0005] 以检测DNA为基础的方法主要有：核酸探针杂交、PCR-RFLP分析、DNA指纹分析、 PCR特异扩增。其中，PCR特异扩增法最为简便、准确、灵敏，在实际检测中应用最为广泛，其 它分析法由于操作难度大，在实际检测中较少应用。
[0006] 针对动物源性食品中存在的问题，我国近些年也加强了肉类安全性的认识，制定 了《传染病防治法》、《动物防疫法》、《食品卫生法》、《进出口商品检验法》等相关的法律法 规。2007年以来，国家标准化管理委员会颁布了关于动物源饲料中动物成分（牛、绵羊、山 羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、骆盤）定性检测国家标准。这些检测标准目前主要集中在利用传 统的常规PCR技术，只能对动物源性肉及肉制品进行单一种的定性检测。在肉类食品样本 实际检测过程中，对于成分不明确或混合的加工制品，需要通过多次检测试验才能确定，其 周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源性肉及肉制品的检测中，这类检测技术已经越 来越不能胜任一次处理几种，甚至十几种动物源制品的特殊需要，尤其是大数量的加工产 品进入商品化生产时，需要更有效的、快速的检测方法。
[0007] 虽然多重常规PCR能同时检测几种动物成分，但在同一反应管中进行多重PCR效 果常常很差，短的片段会被有限扩增，在同源区的重组也会产生人工片段。因此，多重PCR 方法存在两个主要缺陷：一是大量的引物同时存在于一个体系，容易引起非特异性的扩增； 二是由于扩增效率的差异还会导致其中部分目标分子优先扩增。随着添加的引物对数的增 加，以及循环数的增加，这些缺陷所带来的限制会表现的更加明显。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系及 检测方法，快速且高特异性检测猪、羊、牛肉制品的真伪及鉴定是否有掺假，大大提高检测 效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于猪、羊、牛制品的快速防伪鉴定。
[0009] 为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010] -种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR引物体系，包括如下引物对I、引物 对II和引物对III中：
[0011] (1)对猪12SrRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对I :
[0012] 正向引物：5 ' -CTACATAAGATATCCACCACA-3 ' ；
[0013] 反向引物：5' -ACATTGTGGATCTTCTAGGT-3' ；
[0014] (2)对羊细胞色素 c 氧化酶亚基 III (cytochrome c oxidase subunit III)基因 进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对II :
[0015] 正向引物：5 ' -TACACTGTACAGGCATCAG-3 ' ；
[0016] 反向引物：5 ' -CGTGAAGTAGTAGGAGAGTA-3 ' ；
[0017] (3)对牛TNFRSF10A基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对III :
[0018] 正向引物：5 ' -CAGTGAGACTCAGCCTAGAGT-3 ' ；
[0019] 反向引物：5' -CTGCTCCTAGATCAGTGGA-3'。
[0020] 本发明所述的一种快速检测猪羊牛动物源性成分的多重PCR检测方法，其包括如 下步骤：
[0021] 1)以待检样品总DNA为模板，利用所述的多重PCR引物体系进行多重PCR扩增实 验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所述样品总DNA模板为猪、羊、牛物种 肉产品中的一种或一种以上；
[0022] 2)结果判定：待检样品扩增出290bp条带的，判定待检样品为猪源性成分阳性；待 检样品扩增出370bp条带的，判定待检样品为羊源性成分阳性；待检样品扩增出190bp条带 的，判定待检样品为牛源性成分阳性。
[0023] 进一步，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
[0024] CN 105177150 A 说明书 3/7 页
[0025] 所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行90-100 °C下预变性 5-20min，90-100°C变性 20-60s，50-60°C退火 30-60s，70-74°C延伸 60-150s，进行 30-60 次 循环，70-74°C下延伸5-20min，最后在4-20°C下保持> Imin后结束。
[0026] 优选的，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
[0028] 优选的，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行95°C下预变性 lOmin，94°C变性30s，52°C退火45s，72°C延伸90s，进行35次循环，72°C下延伸lOmin，最后 在4 C下保持Imin后结束。
[0029] 更优选的，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：
[0030] CN 105177150 A 说明书 4/7 页
[0031] 本发明通过分析猪、羊和牛3种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因（包括 12S rRNA，cytochrome c oxidase subunit III 和 TNFRSF10A)，进行序列测定及比对后，根 据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，其仅对相应的物种总 DNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，本发明各物种的特异性引物对即引物 对I、引物对II、引物对III的熔解温度相近，退火温度的梯度设置在引物理论熔解温度值 上下5°C的范围内，猪、羊和牛3种动物特异性引物的选择是多重PCR在同一 PCR体系与同 一反应程序中高效扩增的关键技术，且扩增特异性片段大小不一且能够通过电泳分开，非 常适合猪、羊、牛的多重PCR检测。
[0032] 在多重PCR反应条件和体系中，退火温度过高会导致引物与模板不能稳定的结 合，影响扩增效果。退火温度过低则导致引物与模板发生非特异性结合。退火温度的梯度设 置在引物理论Tm值上下5°C的范围内。当引物浓度较小时扩增产物的量随着引物浓度的增 加而增加，当引物浓度到达一个饱和值时，扩增产物的量不再随着引物浓度的增加而增加， 而是基本保持不变。当引物过多时，会导致引物与模板发生非特异性结合，以及引物之间形 成二聚体，影响扩增效果。引物浓度的饱和值和模板的量有关（模板的量越大，引物的饱