N019-20,0. 404 μ mol/L^ DXS6810SEQ ID N021-22, 0.412ymol/L、GATA31E08SEQ ID N023-24,0.188 ymol/L、DXS6800SEQ ID N025-26， 0.278 ymol/L^ DXS981SEQ ID N027-28,0. 130 μmol/L^ DXS10162SEQ ID N029-30, 0.250 ymol/L、DXS6809SEQ ID N031-32,0.420 ymol/L、GATA165B12SEQ ID N033-34， 0. 255 ymol/L^ DXS10079SEQ ID N035-36,0. 276 μ mol/L^ DXS10135SEQ ID N037-38, 0. 315 ymol/L^HPRTB SEQ ID N039-40,0. 404 μ mol/L〇
[0051] 人类 X 染色体 STR 的分组为：DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423 为第 一组；Amelogenin、GATA172D05、DXSlOl、DXS9902、DXS7133、DXS6810 为第二组；GATA31E08、 DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809 为第三组；GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB* 第四组。
[0052] 每一对特异性引物对中的一条引物的5'端带有荧光素标记，所述的荧光素标 记方式为：DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423 采用 FAM 标记；Amelogenin、 GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810 采用 HEX 标记；GATA31E08、DXS6800、 DXS981、DXS10162、DXS6809 采用 TAMRA 标记；64了4165812、0乂510079、0乂510135、册訂8采用 ROX标记。该复合扩增体系检测用的内标采用橙色荧光素标记物Orange标记。
[0053] 扩增体系包括引物混合物、酶反应缓冲液、基因组DNA，所述的酶反应缓冲液包括 热启动DNA聚合酶、Bri j58、dNTP、DMS0、Tris-HCl、BSA、DTT，酶反应缓冲液在-20°C的保存 环境中不结冰。以扩增体系为25μ1计算，引物混合物为（5*Primer η?χ)5μ1，酶反应缓冲 液（2. 5*Buffer D) 10 μ 1，基因组DNA (提取模板DNA，直扩检材等）1-3 μ 1。本发明所涉及 到的DNA样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等。 所述DNA样品可用试剂盒法、酸氣仿抽提法、Chelex-100法、磁珠法进彳丁 DNA提取处理。
[0054] 所述的酶反应缓冲液的配方为：KCl 0· IM ;MgC120. 0015mM Jris-HCl 0· 05Μ ;BSA 0· 16mg/ml ;dNTP 0· 2mM ;Brij580.0 OlM ;DTT 0· 02M ;Betaine 0· lmol/L ;DMS00. 40%，百分 比为DMSO原液占酶反应缓冲液的体积百分数，即配置100ml酶反应缓冲液时，加入0. 4ml DMSO原液；热启动DNA聚合酶0. 25U。
[0055] 所述的复合扩增体系的扩增程序是：第一步变性：96°C，2分钟；热循环：94°C 30 秒；60 °C，70秒，共进行27-30个循环；终延伸60 °C，30分钟；保温：15 °C。本发明的扩增产 物需经过毛细管电泳，从而进行片段分析。
[0056] 本发明所采用的19个X-STR的遗传数据统计见结果（表1)。
[0057] 表1 :本发明所采用的19个X-STR的遗传数据统计表
[0059] 其中Marker:基因座位点，Cytogenetic localisation :染色体距离定位， Physical localisation[Mb]:物理距离定位，PIC 〖Polymorphism information content 的缩写，多态性信息含量，HET =Heterozygotie的缩写，杂合度，用来衡量基因的多态 性，MEC :Mean paternity exclusion change 的缩写，平均非父排除率，F1D :Power of Discrimination的缩写，个人识别能力。
[0060] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：本发明所涉及的19个X染色体STR位点 比现在市场上绝大多数的商业化试剂盒位点数量多，能够更好的满足公安、司法机关对于 X-STR检测的高要求。根据对汉族人群1248个样本的统计，可见：本发明所选择的位点具 有较高的多态性信息、个体识别率比较高。基因组DNA可通过提取模板DNA、直扩检材等方 式获得，模板适应范围广。引物的特异性较高，无非特异性产物生成且信号稳定。
【附图说明】
[0061] 图1为酶反应缓冲液（2. 5*Buffer D)的优化实验中Brij58的浓度比较结果；
[0062] 图2为酶反应缓冲液（2. 5*Buffer D)的优化实验中DMSO的浓度比较结果；
[0063] 图3. 1和图3. 2为本发明所给出的最优化组分扩增效果图；
[0064] 图4. 1和图4. 2为本发明所涉及的物种特异性的检测实验结果；
[0065] 图5. 1和图5. 2为几种检材的扩增效果图谱；
[0066] 图6. 1和图6. 2为XX性反转综合征病例的扩增图谱；
[0067] 图7. 1、7. 2、7. 3和7. 4为同父异母姐妹亲权关系鉴定扩增图谱。
【具体实施方式】
[0068] 下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0069] 下列表2列举比较了现在市面上常见的X-STR试剂盒的基因座位点信息、X染色 体相关的专利发表的复合扩增体系和本发明的试剂盒。
[0070] 表2现有的X-STR复合扩增体系与本发明扩增体系对比
CN 105177125 A 说明书 6/12 页
[0073] 尽管目前公安司法等机关对于X-STR试剂盒的需求很强烈，但是上述表格中涉及 到的试剂盒或复合扩增体系或因为价格或因为无法商品化所以在现实的公安、司法及各个 院所实验室的使用普遍率不是很高。所以开发出一个位点数量多、遗传多态性高、个体识别 力强的X-STR试剂盒是具有非常明朗的市场前景的。
[0074] 实施例1人类染色体20个短串联重复序列复合扩增体系设计
[0075] 1.引物设计
[0076] 所述引物采用Prime Premier5和NCBI Blast等软件设计而成，设计引物时应当 确保各引物的Tm值在（60 ± 2) °C的范围内，扩增效率接近并确保各对引物的扩增产物大小 不同并足以在毛细管电泳中区分开。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和 不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异性产物或者二聚体的需要重新设 计，直到得到符合要求的引物序列。
[0077] 选用人源DNA模板，分别用上述20对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1. 5%的 琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到20对引物共同的扩增条 件，最终期望的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的 目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。
[0078] 2.荧光标记系统建立
[0079] 选择了 FAM、HEX、TAMRX、ROX建立四色荧光标记系统，将所设计的20对引物分为四 组进行荧光标记。每组采用一种荧光标记，分别是FAM、HEX、TAMRX、R0X。得到荧光标记引 物后，用其相配对的非荧光引物组合，然后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3500遗传 分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。其后， 将同一荧光标记的4对或5对或6对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3500遗 传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率，以 及判断该4对或5对或6对引物混合扩增是否引起非特异性。最后，根据单重扩增及组合扩 增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将20对引物混合置于同一管