涤 3 次 并用IOmL上样缓冲液（20mM Na3PO4,0.5M NaCl ;IOmM咪挫，pH7. 4)重悬后进行超声破碎， 操作条件为：50HZ，200W，超声3S，间歇5S，工作100次。超声完成后，12000g离心15min分 别收集沉淀和上清后进行电泳检测。发现重组蛋白AtcC以可溶性表达方式存在于菌体中， 激光薄层扫描分析显示，目标蛋白占菌体总蛋白的35%左右。
[0084] 将上述获得的超声破碎上清液用0. 45 μπι的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns (GE healthcare公司产品），按照说明书的方法进行重组蛋白的纯化。具 体方法如下：
[0085] 1)用5mL注射器吸满蒸馏水，拧开柱的塞子，用提供的接头将柱和注射器连接上， 以lmL/min流速洗柱。
[0086] 2)用IOmL上样缓冲液平衡，lmL/min流速。
[0087] 3)将重组蛋白（过滤后的超声破碎上清液）上样，lmL/min流速。
[0088] 4)用20mL上样缓冲液，以lmL/min流速洗柱。
[0089] 5)用 20mL 洗涤缓冲液（20mM Na3P04,0. 5M NaCl，40mM 咪唑，ρΗ7· 4)，以 lmL/min 流速洗柱。
[0090] 6)用 IOmL 洗脱缓冲液（20mM Na3PO4,0· 5M NaCl，IOOmM 咪唑，ρΗ7· 4)，以 lmL/min 流速洗脱，分管收集，每管lmL，12% SDS-PAGE检测，合并洗脱组分中含有目的蛋白的样品， 冻干保存备用。重组蛋白经此镍柱亲和层析纯化后，SDS-PAGE显示其纯度在90%以上。
[0091] 实施例3共固定化多酶体系的构建
[0092] 取实施例1的得到的重组融合蛋白AtcAB 50mg与实施例2的得到的重组蛋白 AtcC 25mg同时加入到12. 5mL的含80g/L聚乙烯醇及15g/L海藻酸钠的用0· IN NaOH调pH 到7. 5的水溶液中，至总蛋白终浓度为6mg/mL，充分混匀后，加入750 μ L质量分数为10% 的戊二醛溶液，充分混匀后于4°C下交联反应3h。将反应液用6号针头注射器逐滴滴入到 20g/L的氯化钙溶液中，滤出小球体。将小球体放置在20g/L的氯化钙溶液中，再浸泡硬化 lh。滤出小球体后在4°C下用400mL质量分数为0. 02%的戊二醛溶液再交联3h，再滤出小 球体。用pH为7. 5的含15g/L KH2PO4的洗涤液洗涤3次，置于4°C备用。
[0093] 实施例4共固定化酶系的催化转化反应
[0094] 建立体积为IL的转化反应体系，转化反应体系及反应条件如下：体系中含有实施 例3中得到的含有共固定化酶系的小球体150g，反应物DL-ATC 15g，KH2PO4L 5g，山梨醇 l〇〇g，转化反应体系pH为7. 5 ;反应温度为30°C，搅拌转速为150转/分钟，反应时间为Ih。
[0095] 反应完成后，取反应液检测L-半胱氨酸的含量，具体的检测方法见参考文献： Gaitondej Μ. K. , A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids. Biochemistry Journal，1967, 104,627-633.根据产物L-半胱氨酸与底物DL-ATC的分子摩尔比，计算转化 率。在此反应条件下，DL-ATC转化为L-半胱氨酸的转化率达90%。
[0096] 转化反应完成后，通过过滤即可把小球体回收，回收的小球体用KH2PO4浓度为2g/ L、山梨醇浓度为200g/L、pH为7. 5的洗涤缓冲液洗涤3次，再次用其建立上述转化反应体 系，进行转化反应。如此反复循环，实现共固定化酶系多次转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。
[0097] 在此条件下，固定化酶系使用八个周期时，反应体系的转化率仍在70%以上，各个 周期的转化率如下表：
[0099] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 共固定化酶系的制备 将由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶组成的融合蛋白以及氮-氨甲 酰-L-半胱氨酸水解酶加入到含有聚乙烯醇和海藻酸钠的水溶液中，充分混匀后，加入戊 二醛溶液进行交联反应；将反应液滴入氯化钙溶液中，滤出小球体；小球体再浸泡在氯化 钙溶液中进行硬化处理；滤出小球体后再用戊二醛溶液交联，再滤出小球体，洗涤后备用； 所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的氮-氨甲酰-L-半胱氨酸 水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示； (2) 共固定化酶系转化DL-ATC生成L-半胱氨酸 将步骤（1)得到的含有共固定化酶系的小球体加入到含有DL-ATC、KH2PO4、山梨醇的体 系中进行反应得到L-半胱氨酸。2. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的融合蛋白通过包括如下步骤的方法进行制备： 1) 将序列如SEQ ID NO. 3所示的DNA片段通过AWeI、及连接到pET-28a(+)载体 上构建得到表达载体pET-atcAB ; 2) 将表达载体pET-atcAB转入大肠杆菌BL21 (DE3)后进行诱导表达，表达完成后进行 细胞破碎，用Ni2+亲和层析的方法纯化得到目的蛋白。3. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶通过包括如下步骤的方法进行制备： 1) 将序列如SEQ ID NO. 6所示的DNA片段通过AWeI、及连接到pET-28a(+)载体 上构建得到表达载体pET-atcC ; 2) 将表达载体pET-atcC转入大肠杆菌BL21 (DE3)后进行诱导表达，表达完成后进行细 胞破碎，用Ni2+亲和层析的方法纯化得到目的蛋白。4. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的融合蛋白与氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的质量比为1:0. 2-1:1 ; 步骤（1)中所述的含有聚乙烯醇和海藻酸钠的水溶液为pH7.5、含80g/L聚乙烯醇及 15g/L海藻酸钠的水溶液； 步骤（1)中所述的氯化钙溶液的浓度为20g/L; 步骤（1)中洗涤所滤出小球体的溶液为pH7.5、含15g/LKH2PO4的水溶液。5. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（1)中第一次交联所用的戊二醛溶液的质量分数为10%，戊二醛溶液的体积为交 联反应体系总体积的3%-8%，交联反应的时间为3h ; 步骤（1)中第二次交联所用的戊二醛溶液的质量分数为0. 02%，交联反应的时间为3h。6. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（1)为：取融合蛋白与氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶按质量比为1:0. 2-1:1的量的 比例加入到pH7. 5、含80g/L聚乙烯醇及15g/L海藻酸钠的水溶液中，至总蛋白终浓度为 4-10mg/mL，充分混匀后，加入质量分数为10%的戊二醛溶液使该溶液在交联反应体系中的 体积分数达到3%-8%，充分混匀后于4°C下交联反应3h ;将反应液滴入到20g/L的氯化钙 溶液中，滤出小球体；将小球体放置在20g/L的氯化钙溶液中，再浸泡硬化Ih ;滤出小球体 后在4°C下用质量分数为0. 02%的戊二醛溶液再交联3h，再滤出小球体；用pH为7. 5的含 15g/LKH2PO4的水溶液洗涤3次，置于4°C备用。7. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在 于：步骤（2)的反应体系为：含有共固定化酶系的小球体浓度为50-200g/L，DL-ATC浓度为 5-20g/L，KH2PO4浓度为 0? 5-2g/L，山梨醇浓度为 10-200g/L，pH为 6-8。8. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（2)中所述的反应的条件为：反应温度为28-37°C，搅拌转速为100-200转/分钟，反应 时间为2-6h。9. 根据权利要求1所述的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于： 步骤（2)反应完成后通过过滤回收含有共固定化酶系的小球体，再用KH2PO4浓度为2g/L、山 梨醇浓度为200g/L、pH为7. 5的洗涤缓冲液洗涤小球体后重复用于步骤（2)。10. -种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的共固定化酶系，其特征在于：通过权利要 求1中的步骤（1)得到。
【专利摘要】本发明公开了一种固定化酶转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸合成L-半胱氨酸的方法。本发明利用聚乙烯醇-海藻酸钠复合载体通过交联-包埋-交联的工艺将含DL-ATC消旋酶、L-ATC水解酶的融合蛋白（SEQ？ID？NO.1）以及氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶（SEQ？ID？NO.4）固定得到共固定化酶系，其能够转化DL-ATC生成L-半胱氨酸。编码融合蛋白、氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的基因的序列分别如SEQ？ID？NO.2、5所示，将所述基因构建到pET-28a上通过诱导表达和纯化得到高纯度目标蛋白。本发明的共固定化酶系转化效率、稳定性高，在L-半胱氨酸的合成中具有重要的工业应用价值。
【IPC分类】C12N9/90, C12P13/12, C12N11/08, C12N11/10, C12N9/14
【公开号】CN105177076
【申请号】
【发明人】杨波, 胡征
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年10月8日