-噻唑啉-4-羧酸合成l-半胱氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化酶转化DL-2-氨基-Λ 2_噻 唑啉-4-羧酸（DL-ATC)合成L-半胱氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] L-半胱氨酸是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基（-SH)的 氨基酸，具有重要的生理功能。目前已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。我国是 L-半胱氨酸生产大国，占全球总产量的80%，产品不仅占领了国内市场，而且大量出口到 世界各地。目前，国内生产L-半胱氨酸主要是依靠人或动物的毛发中的角蛋白经酸水解 提取L-胱氨酸后，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法收率低，能耗高，水解过程产 生大量刺激性气体，废液处理困难，对环境污染严重。近年来，随着L-半胱氨酸生产技术 的发展，国际上逐步以微生物转化法取代了毛发水解制备L-半胱氨酸。微生物转化法中以 DL-ATC酶法转化最具优势。DL-ATC酶法转化是利用微生物细胞内所含有的转化酶系（包 括DL-ATC消旋酶、L-ATC水解酶、硫-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶、氮一氨甲酰-L-半胱氨 酸水解酶）将DL-ATC生物转化为L-半胱氨酸。这个方法是1977年日本Sano等人提出的， 他们从土壤中筛选到的假单胞菌（Pseudomonas sp.)可将DL-2-氨基-Λ 2_噻唑啉-4-羧 酸（DL-ATC)生物转化为L-半胱氨酸。此法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物 少、产物均一、易提取等优点，很适宜合成用发酵法生产比较困难的氨基酸。
[0003] 虽然国际上微生物酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸这一技术已有较为成熟的应 用，但由于存在菌体使用寿命不长（由于L-ATC水解酶在生理温度的热稳定性不高，易变 性，其半衰期只有100小时左右），酶促反应途径中的酶均为诱导酶，对底物响应时间长，野 生菌株中酶量不足，活力相对较低等使得整套工艺的连续生产能力被大大限制，生产成本 居高不下，一般该法只用于医用级高纯度L-半胱氨酸的产生。特别是野生菌中存在半胱氨 酸的分解代谢途径，转化过程中积累的L-半胱氨酸被分解，释放出大量的的H2S气体，严重 影响了产率。而目前由于对菌株基因组信息的缺乏以及一些未知的原因，对野生假单胞菌 的基因工程改造工作难度很大，一直进展不前。
[0004] 由此可见，创立一套高效、高产率的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的新方法就 显得十分重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于解决现有技术存在的利用野生型假单胞菌法转化DL-2-氨 基-Λ 2-噻唑啉-4-羧酸（DL-ATC)合成L-半胱氨酸工艺中遇到的技术问题，提供一种更 为高效的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] -种固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
[0008] (1)共固定化酶系的制备
[0009] 将由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶组成的融合蛋白AtcAB以及 氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC加入到含有聚乙烯醇和海藻酸钠的水溶液中，充分混 匀后，加入戊二醛溶液进行交联反应。将反应液逐滴滴入氯化钙溶液中，滤出小球体。小球 体再浸泡在氯化钙溶液中进行硬化处理。滤出小球体后再用戊二醛溶液交联，再滤出小球 体，洗涤后备用。
[0010] 所述的融合蛋白AtcAB的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码该融合蛋白的基 因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述的氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 4所示；编码该氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的基因的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 5 所示。
[0011] (2)共固定化酶系转化DL-ATC生成L-半胱氨酸
[0012] 将步骤⑴得到的含有共固定化酶系的小球体加入到含有反应物dl-atc、kh2po 4、 山梨醇的体系中进行反应得到L-半胱氨酸。
[0013] 步骤（1)中所述的融合蛋白优选通过包括如下步骤的方法进行制备：
[0014] 1)将序列如SEQ ID NO. 3所示的DNA片段通过NdeI、EcoRI连接到pET-28a(+)载 体上构建得到表达载体pET-atcAB。
[0015] 2)将表达载体pET-atcAB转入大肠杆菌BL21 (DE3)后进行诱导表达，表达完成后 进行细胞破碎，用Ni2+亲和层析的方法纯化得到目的蛋白。
[0016] 步骤（1)中所述的氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶优选通过包括如下步骤的方法 进行制备：
[0017] 1)将序列如SEQ ID NO. 6所示的DNA片段通过NdeI、EcoRI连接到pET-28a(+)载 体上构建得到表达载体pET-atcC。
[0018] 2)将表达载体pET-atcC转入大肠杆菌BL21 (DE3)后进行诱导表达，表达完成后进 行细胞破碎，用Ni2+亲和层析的方法纯化得到目的蛋白。
[0019] 所述的表达载体pET_28a(+)为Novagen公司产品，可随意从市场购买；所述大肠 杆菌BL21 (DE3)菌株为Promega公司产品，亦可随意从市场购买。
[0020] 步骤（1)中所述的融合蛋白与氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的质量比优选为 1:0. 2-1:1〇
[0021] 步骤（1)中所述的含有聚乙烯醇和海藻酸钠的水溶液优选为pH 7. 5、含80g/L聚 乙烯醇及15g/L海藻酸钠的水溶液。
[0022] 步骤（1)中所述的氯化钙溶液的浓度优选为20g/L。
[0023] 步骤（1)中第一次交联所用的戊二醛溶液，戊二醛的质量分数优选为10%，加入 的戊二醛溶液的体积优选为交联反应体系总体积的3% -8%，交联反应的时间优选为3h。
[0024] 步骤（1)中第二次交联所用的戊二醛溶液，戊二醛的质量分数优选为0.02%，交 联反应的时间优选为3h。
[0025] 步骤⑴中洗涤所滤出小球体的溶液优选为pH 7. 5、含15g/L KH2PO4的水溶液。
[0026] 更优选的，步骤（1)为：取融合蛋白与氮-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶按质量比为 1:0. 2-1:1的量的比例加入到pH 7. 5、含80g/L聚乙烯醇及15g/L海藻酸钠的水溶液中，至 总蛋白终浓度为4-10mg/mL，充分混匀后，加入一定体积的质量分数为10%的戊二醛溶液 使该溶液在交联反应体系中的体积分数达到3 % -8 %，充分混匀后于4°C下交联反应3h。将 反应液逐滴滴入到20g/L的氯化f丐溶液中，滤出小球体。将小球体放置在20g/L的氯化钙 溶液中，再浸泡硬化lh。滤出小球体后在4°C下用质量分数为0. 02%的戊二醛溶液再交联 3h，再滤出小球体。用pH为7. 5的含15g/L KH2PO4的水溶液洗涤3次，置于4°C备用。
[0027] 步骤（2)的反应体系优选为：含有共固定化酶系的小球体浓度为50_200g/L，反应 物 DL-ATC 浓度为 5-20g/L，KH2PO4浓度为 0· 5-2g/L，山梨醇浓度为 10-200g/L，pH 为 6-8。
[0028] 步骤（2)中所述的反应的条件优选为：反应温度为28_37°C，搅拌转速为100-200 转/分钟，反应时间为2-6h。
[0029] 在步骤（2)所述的反应条件下，DL-ATC转化为L-半胱氨酸的转化率达75-90%。
[0030] 转化反应完成后，通过过滤即可把含有共固定化酶系的小球体回收，回收的小球 体用KH2PO4浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、pH为7. 5的洗涤缓冲液洗涤2-3次后，可再 次用其建立上述转化反应体系，进行转化反应。如此反复循环，实现了共固定化酶系多次转 化DL-ATC合成L-半胱氨酸。在本发明条件下，共固定化酶系使用八个周期时，仍保持70% 以上的酶转化活力，为实现L-半胱氨酸的工业化生产奠定了基础。
[0031] 一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的共固定化酶系，通过上述步骤（1)得到。
[0032] 本发明将来自假单胞菌的DL-ATC消旋酶（atcA)、L-ATC水解酶（atcB)基因通过 密码子优化，在优化后的两基因序列中间添加一段刚性连接肽序列。形成atcA+atcB的融 合表达框，通过化学合成全基因并克隆入表达载体pET_28a(+)后进行融合蛋白的表达与 纯化；其次，将氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶（atcC)基因过密码子优化后通过化学合成 全基因并克隆入表达载体pET_28a(+)后亦进行融合蛋白的表达与纯化；第三，将上述二种 重组蛋白利用聚乙烯醇-海藻酸钠复合载体通过交联-包埋-交联的工艺进行酶的共固定 化，制得能转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的固定化多酶体系。最后，确定固定化多酶体系催 化转化反应的条件，从而形成完整的固定化酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的新方法。
[0033] 和现有的利用假单胞菌转化DL-ATC制备L-半胱氨酸的传统方法相比，本发明方 法的优点和效果如下：
[0034] (1)将转化途径中的关键酶基因 atcA与atcB基因进行密码子优化后，利用刚性 连接肽将此二基因进行首尾相连而进行融合表达，表达效率高（目的蛋白占细胞总蛋白的 25%左右）；融合蛋白以可溶性形式存在，具有两种酶活力，相当于一次表达即可获得两种 目标酶；利用组氨酸标签进行Ni2+亲和层析，纯化效率高，一次亲和层析纯化即可达到90% 的纯度；
[0035] (2)将转化途径中的第三个关键酶基因 atcC进行密码子优化后进行全基因合成， 成功的在大肠杆菌中实现了尚表达（目的蛋白占细胞总蛋白的35%左右），目的蛋白以可 溶性活性形式存在细胞中，利用组氨酸标签进行Ni2+亲和层析，纯化效率高，一次亲和层析 纯化即可达到90%以上的纯度；
[0036] (3)利用海藻酸钠-聚乙烯醇复合载体，采用戊二醛二次交联的共固定化技术，对 上述重组蛋白进行了共固定化，有效解决了天然酶活性低、稳定性差的问题，同时克服了普 通固定